هضم البروتين، أولترافيلتراتيون، وحجم الاستبعاد اللوني لتحسين عزل اكسوسوميس من بلازما الدم البشري والمصل
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتنقية اكسوسوميس من البلازما والمصل مع انخفاض تنقية المشارك من بروتينات الدم غير اكسوسومال. ويشمل البروتوكول الأمثل ultrafiltration وعلاج مبطلات وحجم الاستبعاد اللوني. تنقية اكسوسوميس فوائد تحليل المتلقين للمعلومات، بما في ذلك تقدير أكثر دقة من حويصلات وتوصيف البروتين المعزز.
Abstract
اكسوسوميس، نوع من نانوفيسيكلي صدر من جميع أنواع الخلايا، يمكن أن تكون معزولة عن أي السوائل الجسدية. محتويات اكسوسوميس، بما في ذلك البروتينات والكشف، فريدة من نوعها للخلايا التي يتم اشتقاق ويمكن أن تستخدم كمؤشرات للمرض. عدة بروتوكولات تخصيب مشتركة، بما في ذلك تنبيذ فائق، تسفر عن اكسوسوميس محملة بالملوثات بروتين قابل للذوبان. على وجه التحديد، لقد وجدنا أن البروتينات الأكثر وفرة في الدم غالباً ما تنقية يشترك مع اكسوسوميس ويمكن الخلط بين دراسات البروتين المصب، وإحباط تحديد المرشحين العلامات البيولوجية وفرة منخفضة. لقلق إضافي إيريبرودوسيبيليتي اكسوسومي البروتين الكمي بسبب التمثيل غير متناسقة من مستويات البروتين غير اكسوسومال. ووضع البروتوكول بالتفصيل هنا لإزالة البروتينات غير اكسوسومال التي شارك تنقية جنبا إلى جنب مع اكسوسوميس، مشيراً إلى الصرامة في عملية تنقية اكسوسومي. وقورنت خمس طرق استخدام إقران بلازما الدم والمصل من خمس جهات مانحة. وكشف التحليل باستخدام نانوحبيبات تتبع تحليل وفحص البروتين حمض بيسينتشونينيك الصغرى أن بروتوكول المجمعة باستخدام أولترافيلتريشن وحجم الاستبعاد اللوني أسفرت عن إثراء حويصلة الأمثل وإزالة البروتين للذوبان. واستخدمت للتحقق من أنه تم استنفاد بروتينات الدم الوفيرة المتوقعة، بما في ذلك الزلال وأبوليبوبروتينس، النشاف الغربية.
Introduction
اكسوسوميس نانوفيسيكليس (يتراوح حجمها بين 30 نانومتر إلى 150 nm) نشرته تقريبا جميع الخلايا الموجودة في جسم الإنسان لتسهيل الاتصالات خلية إلى خلية العمليات1،2. من المثير للاهتمام، التغييرات تكوين اكسوسوميس تبعاً لخلايا المنشأ، فضلا عن الحالة الصحية ل الفرد3،4،5. بالإضافة إلى ذلك، اكسوسوميس يمكن استردادها من سوائل بيولوجية عديدة مثل: اللعاب والبول والدم2. وبسبب هذه الميزات، تعتبر اكسوسوميس يكون مصدرا جيدا للمؤشرات الحيوية في الأمراض. ولسوء الحظ، لا يوجد أي أسلوب القياسية لعزل اكسوسوميس. النظر بعض معامل الطرد المركزي متعددة الخطوات، مع خطوة عالية السرعة نهائية في س 100,000 ز استخدام التدرجات الكثافة كأسلوب المعيار الذهبي لعزل اكسوسومي. ومع ذلك، أظهرت دراسات أجريت مؤخرا أن تنبيذ فائق الحث على تجميع اكسوسوميس مع البروتينات القابلة للذوبان وأخرى اكسوسوميس، بالإضافة إلى التأثير على سلامة اكسوسومي، التي قد تعوق تطبيقات المصب6،7 . تشمل أساليب أخرى مشتركة من العزلة اكسوسومي، ولكن لا تقتصر على: هطول الأمطار بالتجاري البولي إثيلين غليكول (شماعة) على أساس الكواشف والطرد المركزي أولترافيلتريشن وحجم الاستبعاد اللوني (ثانية). إثراء الكواشف التجارية استخدام البوليمرات البولي إثيلين غليكول (شماعة) اكسوسوميس التي تسبب لهم أن يعجل وتشكيل من بيليه. قيود استخدام هذا البوليمر تلوث ببقايا شماعة البوليمر، ووفرة من البروتينات اكسوسومال غير قابلة للذوبان في المنتج النهائي. ويستخدم أولترافيلتريشن الطرد المركزي لتنقية وتركز حويصلات استخدام غشاء السليولوز؛ يتم الاحتفاظ اكسوسوميس فوق عامل التصفية، بينما أصغر من الشوائب والبروتينات الأخرى تمر عبر غشاء7،8. تماما مثل أساليب أخرى، قد أولترافيلتراتيون الطرد المركزي قدرة محدودة على تنقية اكسوسوميس بسبب الاحتفاظ بمستويات عالية من البروتينات غير اكسوسومال، بما في ذلك مجمعات البروتين والمجاميع. وأخيراً، يستخدم تنقية ثانية راتنج مسامية لفصل الجزيئات بحجم. ثانية وقد أظهرت نتائج واعدة، التغلب على معظم المشاكل التي تعاني منها مع الأساليب الأخرى التي استولت على غالبية البروتينات الملوث والحفاظ على سلامة اكسوسومال، منذ عزل استناداً إلى خطورة أو أنظمة الضغط المنخفض7، 9. ومع ذلك، يؤثر عزلة أكبر المجاميع والبروتينات الدهنية البروتين10 المشارك خلال ثانية نقاء إعداد اكسوسومي النهائي. في حين تم اختبار بعض الأساليب لتنقية اكسوسومي من supernatants ثقافة الخلية والبلازما7أو9،البلازما فقط11، لا توجد معلومات حول أداء طرق مباشرة مقارنة الدم البلازما والمصل من الفرد نفسه.
هنا، علينا أن نركز على تنقية الدم اكسوسوميس بمقارنة مجموعة متنوعة من مهام سير العمل لتحديد ما إذا كانت تقنيات التخصيب حويصلة قابل للنقل بين البلازما والمصل. نانوحبيبات تتبع التحليل ووصمة عار الغربية استخدمت لقياس الاختلافات في تكوين اكسوسومي التركيز والنقاء والبروتين في المنتجات النهائية. يزيد أرقام حويصلة الأسلوب النهائي، المفصلة في هذا البروتوكول، ويقلل من مستويات البروتين غير اكسوسومال. الأهم من ذلك، هو أظهر انخفاض حاد للبروتينات عجلت المشترك المشتركة بما في ذلك الزلال وأبوليبوبروتينس. وفرة عالية من هذه البروتينات اثنين في الدم وتواتر فيه أنها شاركت تنقية مع اكسوسوميس أسباب التضارب بين عينات “النقية”، وانحراف التحليلات المتلقين للمعلومات. ويشمل هذا البروتوكول استخدام راتنج SEC المتوفرة تجارياً؛ وتتألف من الخرز المليئة بالثغرات التي يمكن أن تدخل البروتينات أقل من 700 كاتشين الخرز الراتنج. مرة واحدة في الداخل، يتم الاحتفاظ بالبروتينات قبل يجند أوكتيلاميني. النذرة يتكون من اكسوسوميس وجزيئات أكبر من 700 كاتشين12. بالإضافة إلى ذلك، بغية الحد من المجاميع البروتين وأبوليبوبروتينس التي تهرب حبة الملائمة، ندرج خطوة هضم حوزتي في سير العمل. حاليا، هناك لا توجد تقنية واحدة قادرة على تحقيق الحد الأقصى من الغلة اكسوسومي بينما الحد المشترك تنقية البروتينات غير اكسوسومال. وتبين هذه الدراسة أن بروتوكول تنقية يجمع بين المعالجة هضم حوزتي مع أساليب الاسترداد وتنقية متعددة يمكن استخدامها لزيادة الغلة اكسوسومي والنقاء من مصل الدم والبلازما.
Protocol
Representative Results
Discussion
أسلوب أمثل لزيادة نقاء والعائد من اكسوسوميس من الدم سوف تزيد القدرة على دقة الألغام حويصلات خارج الخلية كمصدر للمؤشرات الحيوية لأمراض عدة. الأساليب القياسية المستخدمة حاليا لعزل اكسوسوميس، على وجه التحديد، تنبيذ فائق وأساليب هطول الأمطار، ولها عيوب عديدة بما في ذلك تجميع اكسوسومي والتك…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث الأموال الداخلية من CSU (إلى KMD) و ATCC العقد #2016-0550-0002 (عقدا من الباطن من HHSN272201600013C نييد)، ومشروع القانون ووميليندا غيتس (OPP1039688) (إلى KMD/نكج). ونحن نشكر “تجربة البحث جبهة الخلاص الوطني” “الطلاب الجامعيين” (منتدبين) البرنامج الصيفي في جامعة ولاية كولورادو لدعم إضافي.
Materials
| Nanosight | Malvern | NS300 | |
| Benchtop microcentrifuge | Thermo | Legend Mico21 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Waterbath | Benchmark | B2000-4 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23227 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23235 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD-Millipore | UFC510096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD-Millipore | UFC800324 | |
| Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | BIORAD | 7311550 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | THERMO | NP0323BOX | |
| Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm | BIORAD | 1620112 | |
| Proteinase K, Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
| SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
| 4-Chloro-1-naphthol | Millipore-SIGMA | C6788 | |
| Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | Primary and secondary antibodies |
| ALB Antibody (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | Primary antibody |
| apoB Antibody (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | Primary antibody |
| apoA-I Antibody (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | Primary antibody |
Referências
- Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. The biogenesis and functions of exosomes. Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Schorey, J. S., Harding, C. V. Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story. J Clin Invest. 126 (4), 1181-1189 (2016).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1652), (2014).
- Nilsson, J., et al. Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer. Br J Cancer. 100 (10), 1603-1607 (2009).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27269 (2015).
- Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Sci Rep. 6, 24316 (2016).
- de Menezes-Neto, A., et al. Size-exclusion chromatography as a stand-alone methodology identifies novel markers in mass spectrometry analyses of plasma-derived vesicles from healthy individuals. J Extracell Vesicles. 4, 27378 (2015).
- Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Scientific Reports. 7 (1), 11561 (2017).
- Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection. Sci Rep. 6, 37975 (2016).
- Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).
- Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Sweeney, P. J., Walker, J. M. Proteinase K (EC 3.4.21.14). Methods Mol Biol. 16, 305-311 (1993).
- Baranyai, T., et al. Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods. PLoS One. 10 (12), e0145686 (2015).
