כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבוע ירידה לפרטים פרוטאז ברקמת העכבר גולמי תמציות באמצעות ספקטרומטר MALDI-TOF.
פרוטאזות יש כמה פונקציות ביולוגיות, כולל הפעלה/איון חלבון ועיכול המזון. המזהה פרוטאז ירידה לפרטים חשוב לחשוף פרוטאז פונקציה. השיטה המוצעת במחקר זה קובע פרוטאז ירידה לפרטים על ידי מדידת משקל מולקולרי של סובסטרטים ייחודי באמצעות מטריקס בסיוע לייזר Desorption/יינון ספקטרומטר מסה זמן-של-טיסה (MALDI-TOF). סובסטרטים מכילים iminobiotin, בעוד האתר cleaved מורכב חומצות אמינו, מרווח מורכב פוליאתילן גליקול. המצע cleaved יפיק משקל מולקולרי ייחודי בעזרת של חומצת אמינו cleaved. אחד היתרונות של שיטה זו הוא כי זה יכול להתבצע בסיר אחד באמצעות דגימות גולמי, הוא גם מתאים להערכת מספר דוגמאות. במאמר זה, אנו מתארים שיטה ניסיונית פשוטה ממוטבת עם דגימות שחולצו מן העכבר רקמת הריאה, כולל רקמות החילוץ, השמה של סובסטרטים עיכול לתוך דגימות, טיהור של סובסטרטים העיכול בתנאים שונים pH , או מידה של משקל מולקולרי של סובסטרטים באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-TOF. לסיכום, טכניקה זו מאפשרת זיהוי היחודיות פרוטאז בדגימות גולמי נגזר תמציות רקמות באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-תוף, אשר יכול בקלות להיות יורה לעיבוד דגימה מרובות.
פרוטאזות לווסת תהליכים פיזיולוגיים על ידי ביקוע חלבונים, הייזום של פעילות פרוטאז לתשמיש, המיקומים מוסדר1. לכן חשוב לזהות את הביטוי ואת הפעילות של רקמות שמווסתים באופן מקומי, וכן לפתח שיטה לגילוי פרוטאזות. פעולת השירות המוצע במחקר זה שמטרתו לזהות ירידה לפרטים פרוטאז במקביל גילוי פרוטאזות.
ישנן כמה שיטות לגילוי פרוטאז ירידה לפרטים. שיטת azocasein הינו ידוע בשל השימוש בו הגילוי של פרוטאזות2 . מוגבלת יכולתו להשיג עוד מידע Zymography הוא שיטה לזיהוי פרוטאז מקיפה אחרת זה יכול לשמש כדי לקבוע את המשקל המולקולרי של פרוטאזות3, אבל זה לא יכול לשמש כדי לבחון המצע ירידה לפרטים. ירידה לפרטים פרוטאז יכול להיקבע על ידי מבחני spectrometric, באמצעות סובסטרטים כגון p-nitroanilide4, מבחני fluorometric, באמצעות קומרין סובסטרטים5 או מבחני פלורסצנטיות תהודה אנרגיה העברה (סריג)6. שיטות אלה מאפשרות זיהוי חד-ירידה לפרטים של סובסטרטים הכלול לבאר בודדת. במחקר הנוכחי, יחודיות פרוטאז של רקמות תמציות נבדק בתנאים שונים, כמו תמציות אלה מכילים פרוטאזות מרובים. פרוטאז פעילות מוסדר על ידי מספר גורמים, כולל ה-pH, קואנזימים, prosthetic קבוצות של יון כוח. לאחרונה, שיטות מבוססות פרוטאומיקס שימשו לזיהוי פרוטאז ירידה לפרטים; לדוגמה, שיטת שדווחו על-ידי Biniossek et al. 7 משתמש את פרוטאום כדי לקבוע ירידה לפרטים המצע אפילו בתמציות גולמי ומאפשר נחישות מדויק של הפעילות המחשוף של פרוטאזות לזהות רצפים מרובים של חומצת אמינו8. עם זאת, שיטה זו אינו מתאים לניתוח של דוגמאות רבות. לעומת זאת, השיטה שלנו מאפשר עיבוד סימולטני של דגימות מרובות ושימוש של Matrix-Assisted לייזר Desorption/יינון זמן-של-טיסה (MALDI-TOF) ספקטרומטר מסה לניתוח מדגם מקלה על זיהוי מהיר וקל של cleaved מצעים.
מאמר זה מתאר שיטה להעריך ירידה לפרטים פרוטאז באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-תוף כדי למדוד את המשקל המולקולרי של מצעים ייחודי. הצורות מולקולרית של מצעים cleaved, יחד עם משקולות מולקולרית התיאורטי שלהם, מוצגים באיור 1 ושל טבלה 1. מחקרים קודמים השתמשו סובסטרטים המכיל מפרידי polyglycine וביוטין9; עם זאת, אלה סובסטרטים מתגברת כי ייתכן ביקע את רצף polyglycine על ידי אנזימים לזהות את רצף גליצין. בנוסף, בזיקה גבוהה בין אבידין ביוטין עלול להוביל קצב החלמה נמוכים. כדי לשפר את החסרונות האלה, במחקר זה שאנו מסונתז מצע ייחודי, אשר הולחן של פוליאתילן גליקול (PEG), iminobiotin, חומצת אמינו שיכול לזהות את האתר המחשוף (איור 1). להפלות בין חומצות אמינו של משקולות מולקולרי דומה, D-סרין נוסף בין חומצת אמינו ביותר באתר cleaved את מרווח פג.
N-מסוף של המצע סומן עם iminobiotin, המאפשרת טיהור זיקה מדגימות גולמי. השימוש iminobiotin במקום ביוטין הוא קריטי; ביוטין יש זיקה חזקה עם אבידין, דבר המתבטא המחירים נמוך השחזור של התווית על-ידי ביוטין מצעים מ שרף אבידין, בזמן אהדה של iminobiotin אבידין יכולים להשתנות על ידי ה-pH. התווית על-ידי Iminobiotin סובסטרטים יהיה לאגד אבידין בתנאים לעיל pH 9, בעוד אבידין משחרר התווית על-ידי iminobiotin סובסטרטים בתנאים להלן pH 4. לכן, iminobiotin שימש לטיהור זיקה10. לסיכום, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לגילוי פרוטאז ירידה לפרטים באמצעות מצעים ייחודי.
פרוטוקול זה משתמש ספקטרומטר מסה MALDI-TOF לזיהוי ירידה לפרטים פרוטאז בדגימות גולמי נגזר תמציות רקמות, יכול בקלות להיות יורה לעיבוד דגימה מרובות. בפרט, אנו מניפולציות pH כדי לגרום לשינוי במצב המצע ירידה לפרטים.
אבידין-ביוטין מורכבים (ABC) השיטה, אשר כבר בשימוש נרחב בביוכימיה עקב יר?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמך בחלקה על ידי ניהון התרופות אוניברסיטת מחקר המענק ניהון התרופות האוניברסיטה (2016), את JP17854179 מספר MEXT גראנט KAKENHI.
Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)aminomethyl]phenoxy resin) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |