De vaststelling van specificiteit uit Protease in muis weefsel extracten met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF: manipuleren van de PH veroorzaken specificiteit wijzigingen
Summary
Hier presenteren we een protocol bij het bepalen van protease specificiteit in ruwe muis weefsel extracten met behulp van spectrometrie van de MALDI-TOF.
Abstract
Proteasen zijn verschillende biologische functies, met inbegrip van eiwit activeren/inactiveren en voedsel spijsvertering. Identificeren van protease specificiteit is belangrijk voor het openbaren van protease-functie. De methode voorgesteld in deze studie bepaalt protease specificiteit door het meten van het molecuulgewicht van unieke substraten met behulp van de Matrix-bijgewoonde Laser desorptie/ionisatie massaspectrometrie Time-of-Flight (MALDI-TOF). De substraten bevatten iminobiotin, terwijl de gekloofd site uit aminozuren bestaat en de spacer uit polyethyleen glycol bestaat. Het gekloofd substraat genereert een unieke molecuulgewicht met behulp van een gekloofd aminozuur. Een van de verdiensten van deze methode is dat het kan worden uitgevoerd in een pot met behulp van de ruwe monsters, en het is ook geschikt voor de beoordeling van meerdere monsters. In dit artikel beschrijven we een eenvoudige experimentele methode geoptimaliseerd met monsters muis longweefsel, met inbegrip van weefsel extractie, plaatsing van spijsvertering substraten in monsters, zuivering van spijsvertering substraten onder verschillende pH-omstandigheden is onttrokken. , en de meting van de substraten molecuulgewicht met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF. Kortom, deze techniek maakt het mogelijk voor de identificatie van protease specificiteit in ruwe monsters afgeleid van extracten van weefsel met behulp van MALDI-TOF massa spectrometrie, die gemakkelijk kan worden opgeschaald voor meerdere monster verwerking.
Introduction
Proteasen reguleren fysiologische processen door het splijten van eiwitten, en de inleiding van protease-activiteit op bepaalde tijdstippen en locaties is gereglementeerde1. Het is daarom belangrijk om te identificeren van de expressie en de activiteit van weefsels die lokaal worden geregeld, en een nieuwe methode voor het detecteren van proteasen te ontwikkelen. De methode voorgesteld deze studie wil identificeren protease specificiteit parallel aan het opsporen van proteasen.
Er zijn enkele methoden voor het opsporen van protease specificiteit. De azocasein methode is bekend om het gebruik ervan in de opsporing van proteasen2 maar is beperkt in zijn vermogen om verdere informatie te verkrijgen. Zymography is een andere uitgebreide protease-detectiemethode die kan worden gebruikt om te bepalen van het molecuulgewicht van proteasen3, maar het kan niet worden gebruikt voor het onderzoeken van substraat specificiteit. Protease specificiteit kan worden bepaald door spectrometrische assays, gebruik van substraten zoals p-nitroanilide4, en fluorimetrische vitrotests, met behulp van cumarine substraten5 of fluorescentie Resonance Energy Transfer (FRET) testen6. Deze methoden inschakelen single-specificiteit detectie van substraten die zijn opgenomen in een enkele goed. In de huidige studie, wordt de protease-specificiteit van extracten van weefsel onderzocht onder verschillende omstandigheden, zoals deze extracten meerdere proteasen bevatten. Protease-activiteit wordt geregeld door verschillende factoren, inclusief pH, coënzymen en prosthetic groepen ion sterkte. Onlangs, proteomics gebaseerde methoden zijn gebruikt voor het identificeren van protease specificiteit; bijvoorbeeld de methode gerapporteerd door Biniossek et al. 7 de Proteoom gebruikt om te bepalen van substraat specificiteit zelfs in grove extracten en nauwkeurige bepaling van de activiteit van de splitsing van proteasen die meerdere aminozuur sequenties8 herkentstaat. Deze methode is echter niet geschikt voor de analyse van de talloze voorbeelden. Daarentegen onze methode maakt de gelijktijdige verwerking van meerdere monsters, en het gebruik van de Matrix-Assisted Laser desorptie/ionisatie Time-of-Flight (MALDI-TOF) massaspectrometrie voor analyse van monster vergemakkelijkt een snelle en gemakkelijke opsporing van de gekloofd substraten.
Dit document schetst een methode om te evalueren van protease specificiteit met behulp van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF voor het meten van het molecuulgewicht van unieke substraten. De moleculaire vormen van gekloofd substraten, samen met hun theoretische molecuulgewichten, worden weergegeven in Figuur 1 pt tabel 1. Eerdere studies hebben gebruik gemaakt van substraten met polyglycine spacers en biotine9; echter zijn deze substraten gebrekkig omdat de volgorde van de polyglycine kan worden cleaved door enzymen die de glycine-volgorde herkent. Daarnaast is de hoge affiniteit tussen avidin en biotine kan leiden tot een lage opbrengst. Om op deze nadelen, in deze studie we gesynthetiseerd een uniek substraat, die bestond van polyethyleenglycol (PEG), iminobiotin en een aminozuur dat de breukzijde (Figuur 1 identificeren kon). Om te discrimineren tussen aminozuren gelijkaardige molecuulgewichten, werd D-serine toegevoegd tussen de pin spacer en het aminozuur op de gekloofd site.
De N-terminal van het substraat werd aangeduid met iminobiotin, waarmee de zuivering van de affiniteit van ruwe monsters. Het gebruik van iminobiotin in plaats van Biotine is van cruciaal belang; Biotine heeft een sterke affiniteit met avidin, wat in terugwinning van de lage tarieven van biotine-geëtiketteerden substraten uit avidin hars, resulteert terwijl iminobiotin de affiniteit voor avidin kan worden gewijzigd door pH. Iminobiotin-geëtiketteerden substraten zal binden aan de avidin in omstandigheden boven pH 9, terwijl avidin releases iminobiotin-geëtiketteerden substraten in voorwaarden hieronder pH 4. Daarom werd iminobiotin gebruikt voor affiniteit zuivering10. In samenvatting beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het opsporen van protease specificiteit met behulp van unieke substraten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol gebruikt van de Spectrometrie van de massa van de MALDI-TOF om te identificeren protease specificiteit in ruwe monsters afgeleid van extracten van weefsel en gemakkelijk voor meerdere monster verwerking kan worden opgeschaald. In het bijzonder, we gemanipuleerd pH om te veroorzaken een verandering in de specificiteit van het substraat.
De avidin-Biotine complexe (ABC) methode, die wijd verbeid in de biochemie vanwege haar bindende specificiteit gebruikt is, werd gebruikt in ons pr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Nihon farmaceutische Universiteit onderzoek subsidie van Nihon farmaceutische Universiteit (2016) en de MEXT KAKENHI Grant nummer JP17854179.
Materials
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)aminomethyl]phenoxy resin) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
Referências
- Neurath, H., Walsh, K. A. Role of proteolytic enzymes in biological regulation (a review). Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (11), 3825-3832 (1976).
- Surinov, B. P., Manoilov, S. E. Determination of the activity of proteolytic enzymes by means of azocasein. Vopr Med Khim. 11 (5), 55-58 (1965).
- Fernandez-Resa, P., Mira, E., Quesada, A. R. Enhanced detection of casein zymography of matrix metalloproteinases. Anal Biochem. 224 (1), 434-435 (1995).
- Erlanger, B. F., Kokowsky, N., Cohen, W. The preparation and properties of two new chromogenic substrates of trypsin. Arch Biochem Biophys. 95, 271-278 (1961).
- Smith, R. E., Bissell, E. R., Mitchell, A. R., Pearson, K. W. Direct photometric or fluorometric assay of proteinases using substrates containing 7-amino-4-trifluoromethylcoumarin. Thromb Res. 17 (3-4), 393-402 (1980).
- Latt, S. A., Auld, D. S., Vallee, B. L. Fluorescende determination of carboxypeptidase A activity based on electronic energy transfer. Anal Biochem. 50 (1), 56-62 (1972).
- Timmer, J. C., et al. Profiling constitutive proteolytic events in vivo. Biochem J. 407 (1), 41-48 (2007).
- Biniossek, M. L., et al. Identification of protease specificity by combining proteome-derived peptide libraries and quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 15 (7), 2515-2524 (2016).
- Yamamoto, H., Saito, S., Sawaguchi, Y., Kimura, M. Identification of protease specificity using biotin-labeled substrates. Open Biochem J. 11, 27-35 (2017).
- Hofmann, K., Wood, S. W., Brinton, C. C., Montibeller, J. A., Finn, F. M. Iminobiotin affinity columns and their application to retrieval of streptavidin. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (8), 4666-4668 (1980).
- Merrifield, R. B. Solid Phase Peptide Synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide. J. Am. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963).
- Hancock, W. S., Battersby, J. E. A new micro-test for the detection of incomplete coupling reactions in solid-phase peptide synthesis using 2,4,6-trinitrobenzenesulphonic acid. Anal. Biochem. 71, 260-264 (1976).
- Marttila, A. T., et al. Recombinant NeutraLite avidin: A non-glycosylated, acidic mutant of chicken avidin that exhibits high affinity for biotin and low non-specific binding properties. FEBS Lett. 467 (1), 31-36 (2000).
- Gravel, R. A., Lam, K. F., Mahuran, D., Kronis, A. Purification of human liver propionyl-CoA carboxylase by carbon tetrachloride extraction and monomeric avidin affinity chromatography. Arch Biochem Biophys. 201 (2), 669-673 (1980).
