मालदी द्वारा माउस ऊतक निष्कर्षों में विशिष्टता को छेड़ने का संकल्प-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री: विशिष्टता परिवर्तन के कारण पीएच हेर-फेर
Summary
यहां, हम एक प्रोटोकॉल पेश करने के लिए कच्चे चूहे ऊतक निष्कर्षों में विशिष्टता का निर्धारण मालदी-तोफ स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर ।
Abstract
कई जैविक कार्य है, प्रोटीन सक्रियण/निष्क्रियता और खाद्य पाचन सहित । की पहचान छेड़ने विशिष्टता समारोह का खुलासा करने के लिए महत्वपूर्ण है । इस अध्ययन में प्रस्तावित विधि मैट्रिक्स का उपयोग अद्वितीय सब्सट्रेट के आणविक भार को मापने के द्वारा विशिष्टता को निर्धारित करता है-असिस्टेड लेजर Desorption/Ionization समय की उड़ान (मालदी-तोफ) मास स्पेक्ट्रोमेट्री । सब्सट्रेट iminobiotin होते हैं, जबकि सट साइट में अमीनो अम्ल होते हैं, और स्पेसर के पास पॉलीथीन के ग्लाइकोल होते हैं. सट सब्सट्रेट एक अद्वितीय आणविक वजन एक सट एमिनो एसिड का उपयोग कर उत्पन्न होगा । इस विधि की खूबियों में से एक यह है कि कच्चे तेल के नमूनों का उपयोग कर एक बर्तन में किया जा सकता है, और यह भी कई नमूनों का आकलन करने के लिए उपयुक्त है । इस अनुच्छेद में, हम एक सरल प्रयोगात्मक माउस फेफड़ों के ऊतकों से निकाले गए नमूनों के साथ अनुकूलित विधि का वर्णन, ऊतक निष्कर्षण सहित, नमूनों में पाचन सब्सट्रेट की नियुक्ति, अलग पीएच शर्तों के तहत पाचन सब्सट्रेट की शुद्धि , और सब्सट्रेट ‘ आणविक वजन की माप मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कर. संक्षेप में, इस तकनीक को कच्चे तेल ऊतक मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री, जो आसानी से कई नमूना प्रसंस्करण के लिए बढ़ाया जा सकता है का उपयोग कर निष्कर्षों से व्युत्पंन में विशिष्टता की पहचान के लिए अनुमति देता है ।
Introduction
teases प्रोटीन सट द्वारा शारीरिक प्रक्रियाओं को विनियमित, और विशिष्ट समय और स्थानों पर छेड़ने गतिविधि की दीक्षा1विनियमित है । । । इसलिए यह अभिव्यक्ति और स्थानीय रूप से विनियमित रहे हैं कि ऊतकों की गतिविधि की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है, और एक उपंयास विधि का पता लगाने के लिए का विकास करने के लिए । इस अध्ययन में प्रस्तावित विधि का उद्देश्य का पता लगाने के लिए समानांतर में चिढ़ा विशिष्टता की पहचान करना है ।
वहां की विशिष्टता का पता लगाने के लिए कुछ तरीके हैं । azocasein विधि अच्छी तरह से2 का पता लगाने में इसके उपयोग के लिए जाना जाता है, लेकिन इसकी क्षमता में और अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए सीमित है । Zymography एक और व्यापक चिढ़ाने का पता लगाने विधि है कि3को छेड़ने के आणविक वजन निर्धारित किया जा सकता है, लेकिन यह सब्सट्रेट विशिष्टता की जांच करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है । चिढ़ा विशिष्टता spectrometric परख द्वारा निर्धारित किया जा सकता है, ऐसे पी के रूप में सब्सट्रेट का उपयोग-nitroanilide4, और fluorometric परख, अनंतमूलि सब्सट्रेट का उपयोग कर5 या प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) परख6। इन तरीकों में निहित सब्सट्रेट के एकल विशिष्टता का पता लगाने के एक अच्छी तरह से सक्षम. वर्तमान अध्ययन में, ऊतक निष्कर्षों की चिढ़ा विशिष्टता विभिंन शर्तों के तहत जांच की है, के रूप में इन निष्कर्षों में कई टीज़ होते हैं । तंग गतिविधि पीएच, coenzymes, कृत्रिम समूहों, और आयन ताकत सहित कई कारकों, द्वारा विनियमित है । हाल ही में, प्रोटियोमिक् आधारित तरीकों को छेड़ने की विशिष्टता की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है; उदाहरण के लिए, Biniossek एट अलद्वारा रिपोर्ट की गई विधि । 7 proteome का उपयोग करता है भी कच्चे तेल के अर्क में सब्सट्रेट विशिष्टता का निर्धारण और कई एमिनो एसिड अनुक्रम8पहचान की है कि टीज़ की दरार गतिविधि का सही निर्धारण की अनुमति देता है । हालांकि, इस विधि के कई नमूनों के विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं है । इसके विपरीत, हमारी विधि एकाधिक नमूनों के एक साथ प्रसंस्करण, और मैट्रिक्स की सहायता लेजर Desorption/Ionization समय की उड़ान (मालदी-तोफ) के उपयोग के लिए सक्षम बनाता है नमूना विश्लेषण के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री के तेजी से और आसान पता लगाने की सुविधा Substrates.
यह कागज एक विधि मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करने के लिए अद्वितीय सब्सट्रेट के आणविक वजन को मापने के लिए के रूप में विशिष्टता का मूल्यांकन करने की रूपरेखा । उनके सैद्धांतिक आणविक भार के साथ-साथ, सट सब्सट्रेट के आणविक रूपों, चित्रा 1 और तालिका 1में दिखाए जाते हैं । पिछले अध्ययनों में polyglycine स्पेसर और9बायोटिन युक्त सब्सट्रेट का इस्तेमाल किया है; हालांकि, इन सब्सट्रेट दोषपूर्ण है क्योंकि polyglycine अनुक्रम एंजाइमों कि glycine अनुक्रम पहचान से सट जा सकता है । साथ ही, उच्च समानता avidin और बायोटिन के बीच एक कम पुनर्प्राप्ति दर करने के लिए लीड हो सकता है । इन कमियों पर सुधार करने के लिए, इस अध्ययन में हम एक अद्वितीय सब्सट्रेट, जो पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी), iminobiotin, और एक एमिनो एसिड है कि दरार साइट (चित्रा 1) की पहचान सकता है से बना था संश्लेषित. समान आणविक भार के अमीनो अम्लों के बीच भेदभाव करने के लिए, डी-serine को खूंटी स्पेसर और सट साइट पर अमीनो अम्ल के बीच जोड़ा गया था.
सब्सट्रेट के एन टर्मिनल iminobiotin के साथ लेबल किया गया था, जो कच्चे तेल के नमूनों से समानता शुद्धि सक्षम बनाता है. बायोटिन की बजाय iminobiotin का उपयोग महत्वपूर्ण है; बायोटिन avidin के साथ एक मजबूत संबंध है, जो avidin राल से बायोटिन-लेबल सब्सट्रेट की कम वसूली दर में परिणाम है, जबकि avidin के लिए iminobiotin के संबध पीएच द्वारा बदला जा सकता है । Iminobiotin-लेबल सब्सट्रेट पीएच 9 से ऊपर की स्थितियों में avidin के लिए बाध्य करेगा, जबकि avidin विज्ञप्ति Iminobiotin-4 पीएच नीचे की स्थितियों में सब्सट्रेट लेबल । इसलिए अपनत्व शुद्धि के लिए iminobiotin का प्रयोग किया गया10. संक्षेप में, हम अद्वितीय सब्सट्रेट का उपयोग कर का पता लगाने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करता है मालदी-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए कच्चे तेल ऊतक निष्कर्षों से व्युत्पंन नमूनों में विशेष रूप से की पहचान और आसानी से कई नमूना प्रसंस्करण के लिए बढ़ाया जा सकता है । वि?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम Nihon फार्मास्युटिकल यूनिवर्सिटी रिसर्च ग्रांट द्वारा Nihon फार्मास्युटिकल यूनिवर्सिटी (२०१६) और MEXT KAKENHI ग्रांट नंबर JP17854179 के हिस्से में सपोर्ट किया गया था ।
Materials
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)aminomethyl]phenoxy resin) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
Referências
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