A determinação da especificidade da Protease no Mouse tecido extrai por espectrometria de massa MALDI-TOF: manipulando o PH para causar alterações de especificidade
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a especificidade da protease no tecido cru rato extratos usando espectrometria de MALDI-TOF.
Abstract
Proteases têm várias funções biológicas, incluindo a digestão de alimentos e ativação/inativação de proteínas. Identificar a especificidade da protease é importante por revelar a função de protease. O método proposto neste estudo determina a especificidade de protease medindo-se o peso molecular de substratos exclusivos usando Matrix-assisted Laser dessorção/ionização de espectrometria de massa de tempo-de-voo (MALDI-TOF). Os substratos contêm iminobiotin, enquanto o site clivado consiste de aminoácidos, e o espaçador é composto por polietileno glicol. O substrato clivado irá gerar um único peso molecular, usando um ácido aminado clivado. Um dos méritos desse método é que pode ser efectuada em uma panela, usando amostras brutas, e é também adequado para avaliar várias amostras. Neste artigo, descrevemos um método experimental simples otimizado com amostras extraídas do tecido do pulmão do rato, incluindo a extracção de tecido, colocação de substratos digestivos em amostras, purificação de substratos digestivos sob condições de pH diferente e medição de peso molecular dos substratos, utilizando espectrometria de massa MALDI-TOF. Em resumo, esta técnica permite a identificação da especificidade da protease em amostras brutas derivado de extratos de tecido usando espectrometria de massa MALDI-TOF, que facilmente pode ser ampliada para múltiplo processamento de amostra.
Introduction
Proteases regulam processos fisiológicos por clivagem de proteínas, e o início da atividade de protease em horários específicos e locais é regulamentado1. Portanto, é importante identificar a expressão e a atividade dos tecidos que são regulamentados localmente e desenvolver um novo método para detectar proteases. O método proposto neste estudo visa identificar a especificidade da protease em paralelo para detecção de proteases.
Existem alguns métodos para a detecção de especificidade de protease. O método azocasein é conhecido por sua utilização na detecção de proteases2 mas é limitado em sua capacidade de obter mais informações. Zimografia é outro método de deteção de protease abrangente que pode ser usado para determinar o peso molecular de proteases3, mas não pode ser usado para examinar a especificidade de substrato. Especificidade de protease pode ser determinada por ensaios de espectrometria, usando substratos tais como p-nitroanilide4e ensaios fluorométrica, utilizando substratos de cumarina5 ou de ensaios de fluorescência ressonância energia transferência (FRET)6. Estes métodos permitem a detecção de single-especificidade de substratos contidos em um único poço. No presente estudo, a especificidade de protease de extratos de tecido é examinada sob várias condições, como estes extratos contêm várias proteases. Atividade de protease é regulada por vários fatores, incluindo pH, coenzimas, grupos prostético e força iônica. Recentemente, métodos baseados em proteômica têm sido usados para identificar a especificidade da protease; por exemplo, o método relatado por Biniossek et al. 7 usa a proteoma para determinar a especificidade de substrato mesmo em extratos brutos e permite a determinação exata da atividade de proteases que reconhecer várias sequências de aminoácidos8clivagem. No entanto, esse método não é adequado para a análise de várias amostras. Em contraste, o nosso método permite o processamento simultâneo de várias amostras e o uso de Matrix-Assisted Laser dessorção/ionização tempo-de-voo (MALDI-TOF) espectrometria de massa para análise de amostra facilita a detecção rápida e fácil do clivada substratos.
Este artigo descreve um método para avaliar a especificidade do protease usando espectrometria de massa MALDI-TOF para medir o peso molecular de substratos exclusivos. As formas moleculares de substratos clivados, juntamente com seus pesos moleculares teóricos, são mostradas na Figura 1 e tabela 1. Estudos anteriores têm utilizados substratos contendo polyglycine espaçadores e biotina9; no entanto, estes substratos são falhos porque a sequência de polyglycine pode ser clivada por enzimas que reconhecem a sequência de glicina. Além disso, a alta afinidade entre avidina e biotina pode levar a uma taxa de recuperação de baixo. Para melhorar estes inconvenientes, neste estudo que nós sintetizado um substrato original, que era composto de polietileno glicol (PEG), iminobiotin e um aminoácido que pode identificar o local de clivagem (Figura 1). Para discriminar entre aminoácidos de peso moleculares similares, D-serina foi adicionado entre o espaçador de PEG e o aminoácido no site entalhado.
O N-terminal do substrato foi rotulado com iminobiotin, que permite a purificação da afinidade de amostras brutas. O uso de iminobiotin em vez de biotina é crítico; Biotina tem uma forte afinidade com avidina, que resulta em taxas de baixa recuperação de substratos de biotina-rotulado de resina avidin, enquanto a afinidade do iminobiotin para avidin pode ser alterada por pH. Iminobiotin-rotulado substratos irão ligar para avidin nas condições acima pH 9, enquanto avidin libera substratos iminobiotin-etiquetadas em condições abaixo de pH 4. Portanto, iminobiotin foi usado para purificação de afinidade10. Em resumo, nós descrevemos um protocolo detalhado para a detecção de especificidade de protease usando substratos exclusivos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo utiliza a espectrometria de massa MALDI-TOF para identificar a especificidade de protease em amostras brutas derivado de extratos de tecido e facilmente pode ser ampliado para múltiplo processamento de amostra. Em particular, estamos manipulados pH para causar uma mudança na especificidade de substrato.
O método (ABC) complexo avidina-biotina, que tem sido amplamente utilizado em bioquímica devido à sua especificidade de ligação, foi utilizado em nosso protocolo. Devido a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado em parte pelo Nihon farmacêutica Universidade bolsa de pesquisa da Universidade de Nihon farmacêutico (2016) e o MEXT KAKENHI Grant número JP17854179.
Materials
| Fmoc-NH-SAL Resin(-[2,4-Dimethoxyphenyl-N-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)aminomethyl]phenoxy resin) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00102 | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00185 | |
| piperidine | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00176 | |
| trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) | WAKO Chemical | 209-1483 | |
| O-(6-Chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HCTU) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00067 | |
| 1-Hydroxy-1H-benzotriazole,monohydrate (HOBt) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00014 | |
| diisopropylethylamine (DIPEA) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00030 | |
| triisopropylsilane (TIS) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00170 | |
| ethanedithiol (EDT) | Watanabe Chemical Co., Ltd. | A00057 | |
| trifluoroacetic acid (TFA) | Millipore | S6612278 403 | |
| acetonitrile | Kokusan Chemical | 2153025 | |
| C18 cartridge column | Waters | WAT051910 | |
| poly(oxyethylene) octylphenyl ether | WAKO Chemical | 168-11805 | Triton X-100 |
| mixing homogenizer | Kinematica | PT3100 | polytron homogenizer |
| Coomassie Brilliant Blue (CBB) -G250 | Nakarai Chemical | 094-09 | |
| glycerol | Nakarai Chemical | 170-18 | |
| N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone (TPCK)-trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | WAKO Chemical | 043-07216 | |
| streptavidin sepharose | GE Healthcare | 17-511-01 | |
| ZipTipC18 | Millipore | ZTC18S096 | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) | Sigma-Aldrich | C2020 | |
| MALDI-TOF mass spectrometry | Bruker Daltonics, Germany | autoflex | |
| 2-iminobiotin | Sigma-Aldrich | I4632 | |
| Fmoc-amino acids | Watanabe Chemical Co., Ltd. |
Referências
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