Co el trasplante de tejido ovárico humano con células endoteliales Ingeniería: una combinación de estrategia basado en la célula acelerada perfusión con entrega directa paracrina
Summary
Para algunos pacientes, la única opción para la preservación de la fertilidad es la criopreservación de tejido ovárico. Desafortunadamente, la revascularización tardía socava la viabilidad folicular. Aquí, presentamos un protocolo de co trasplante de tejido ovárico humano con células endoteliales para utilización como una estrategia basada en celda combinando acelerada la perfusión con una entrega de paracrina directa de moléculas bioactivas.
Abstract
La infertilidad es un efecto secundario frecuente de la quimioterapia o la radioterapia y para algunos pacientes, criopreservación de ovocitos o embriones no es una opción. Como alternativa, un número creciente de estos pacientes se decide criopreservar tejido ovárico para autoinjerto después de la recuperación y remisión. A pesar de mejoras en los resultados entre los pacientes sometidos a auto-trasplante de tejido ovárico criopreservado, revascularización eficaz del tejido injertado sigue siendo un obstáculo importante. Para reducir la isquemia y mejorar así los resultados en pacientes sometidos a trasplante de auto, desarrollamos una estrategia basadas en células vascular para acelerar la perfusión del tejido ovárico. Se describe un método para el trasplante de co de las células endoteliales exógenos (ejecutivos) con tejido ovárico criopreservado en un modelo de xenoinjerto murino. Extendemos este enfoque para emplear a ejecutivos que han sido diseñados para expresar constitutivamente hormona Anti-Mullerian (AMH), permitiendo así sostenido paracrina señalización de entrada a los injertos de ovarianos. Trasplante junto con ejecutivos de mayor volumen folicular y desarrollo del mayor folículo antral, y ejecutivos de AMH-expresión promovieron retención de folículos primordiales quietos. Esta estrategia combinada puede ser una herramienta útil para mitigar la isquemia y la modulación de la activación folicular en el contexto de preservación de fertilidad o infertilidad en general.
Introduction
Cáncer sigue siendo entre las principales causas de muerte en el mundo desarrollado, sin embargo, décadas de investigación han producido avances significativos para la mayoría de los tipos de cáncer y en algunos casos casi se duplicó la supervivencia tasas1. Lamentablemente, los agentes quimioterapéuticos son a menudo gonadotóxica, agotamiento de la reserva de folículos primordiales en los ovarios y reducción de la fertilidad2. Este crecimiento de la población puede beneficiarse de varios métodos de preservación de la fertilidad incluyendo criopreservación de ovocitos o embriones, sin embargo, los pacientes que requieren la pronta iniciación de la terapia del cáncer y los pacientes prepuberales son elegibles para estas opciones. Como alternativa, algunos pacientes han decidido criopreservar tejido ovárico antes de emprender su régimen terapéutico y a la recuperación y la remisión, auto-transplante de tejido para restaurar la fertilidad3. Sin embargo, hasta la fecha, la supervivencia del trasplante y folicular salida auto-trasplante de siguiente siguen siendo relativamente bajos4, principalmente debido a tejido isquemia e hipoxia5,6,7. A pesar de numerosos esfuerzos para mejorar la viabilidad de los injertos corticales ováricas utilizando antioxidantes8,9, pro-angiogénicos citoquinas10,11,12,1 3o manipulaciones mecánicas14, isquemia del injerto en un trasplante después de 5 a 7 días ventana socava la viabilidad y supervivencia del injerto7. Para hacer frente a esto, hemos desarrollado una estrategia basada en la célula para facilitar la anastomosis de vasos de anfitrión y del injerto y así acelerar la reperfusión del tejido ovárico.
Además del insulto isquémico a tejido ovárico injertado en la ventana posterior al trasplante, la alteración de la señalización inter folicular puede contribuir al agotamiento de la piscina15,16. Porque las células endoteliales exógenas (ejecutivos) contribuyen al estables y en funcionamiento los vasos en la periferia del injerto, presentan una oportunidad única para transmitir una entrada molecular definida al tejido trasplantado. Como una prueba del principio, ejecutivos fueron manipulados a niveles express súper fisiológicos de hormona Anti-Mullerian (AMH), un miembro de la superfamilia de beta (TGFβ) factor de crecimiento transformante que se ha demostrado que restringir el crecimiento folicular17. Comparación de la distribución folicular en los injertos trasplantados conjuntamente con control y células de AMH-expresión comprueba si la actividad biológica y potencia de ejecutivos de ingeniería.
En Resumen, mediante la mejora de injerto viabilidad y supresión de la movilización precoz del grupo folicular, este enfoque puede aumentar la productividad de auto trasplanta tejido ovárico en pacientes sometidos a la preservación de la fertilidad. Por otra parte, la plataforma basada en ExEC permite interrogatorio experimental de reguladores moleculares que han sido implicados en el desarrollo folicular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí demostramos que la trasplante de ejecutivos ofrece un beneficio significativo para la viabilidad del tejido ovárico y la función después de xenoinjerto en ratones. Normas para la aplicación clínica de la auto-trasplante de tejido ovárico para la preservación de la fertilidad no han sido conjunto y los parámetros óptimos (tamaño, sitio de trasplante, duración del injerto, etcetera.) 32 , 33 , 34 para may…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Omar Alexander Man para las ilustraciones.
L.M. fue apoyada por un premio de piloto de la clínica de Cornell y beca de investigación traslacional Science Center y un ASRM.
Los autores desean agradecer a James miembros de laboratorio para la lectura crítica del manuscrito.
Materials
| Leibovitz’s L-15 medium | Gibco | 11415064 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240062 | Anti-Anti X100 |
| Sucrose | Sigma | S 1888 | |
| Fibrinogen | Sigma | F 8630 | from bovine plasma |
| Thrombin | Sigma | T 1063 | from human plasma |
| DMSO | Sigma | D 2650 | |
| DMEM | Gibco | 12491015 | |
| Enzyme Cell Detachment Medium | Invitrogen | 00-4555-56 | Accutase |
| Plastic paraffin film | Bemis NA | Parafilm M | |
| Surgical paper tape 2.5 cm | 3M | 1530-1 | Micropore |
| Surgical Paper tape 1.25 cm | 3M | 1530-0 | Micropore |
| Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm | 3M | 1527-0 | Transpore |
| Monofilament Absorbable Suture | Covidien | UM-203 | Biosyn |
| Braided Absorbable Suture | Covidien | GL-889 | Polysorb |
| Povidone-iodine Solution USP 10% | Purdue Products | 67618-153-01 | Betadine Solution Swab Stick |
| Cryoviales | Nunc | 377267 | CryoTube |
| sterile ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Puralube |
| 1.7 ml micro-centrifuge tube | Denville | C-2172 | Eppendorf |
| Anasthesia system | VetEquip | V-1 table top system with scavenging | |
| Endothelial cells | Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA | Isolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells | |
| Trichrome stain | Sigma | HT15-1kt | Trichrome Stain (Masson) Kit |
| Isolectin | Invitrogen | I32450 | isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate |
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