Generering av høy gjennomstrømming tredimensjonale svulst Spheroids for narkotikarelaterte Screening
Summary
Over en rekke sykdom indikasjoner blir flere fysiologisk relevante modeller utviklet og implementert i stoffet funnet programmer. Den nye modell systemet beskrevet her demonstrerer hvordan tredimensjonale svulst spheroids kan kultivert og vist i en høy gjennomstrømming 1536-vel plate-basert system til å søke etter nye onkologi stoffer.
Abstract
Kreftceller har rutinemessig er kultivert i to dimensjoner (2D) på plast underlag. Denne teknikken, men mangler det ekte miljøet en svulst masse er utsatt for i vivo. Solide svulster vokser ikke som ark festet til plast, men i stedet som en samling klonal celler i en tredimensjonal (3D) plass samspill med sine naboer, og med forskjellige romlige egenskaper som avbrudd i normal mobilnettet polaritet. Disse føre 3D-kulturperler celler å erverve morfologiske og mobilnettet egenskaper som til i vivo svulster. I tillegg en svulst er i direkte kontakt med andre celletyper som stromal og immunsystemet cellene, samt den ekstracellulære matrisen fra alle andre celletyper. Matrix avsatt består av macromolecules for eksempel kollagen og fibronectin.
I et forsøk på å øke oversettelsen av forskningsresultater i onkologi fra benken til sengen, begynt mange grupper å undersøke bruk av 3D-modellsystemer i sine narkotikastrategier utvikling. Disse systemene er antatt å være mer fysiologisk relevant fordi de prøver å recapitulate komplekse og heterogene miljø av en svulst. Disse systemene, men kan være ganske komplisert, og selv om det er mottakelig for vekst i 96-brønnen formater, og noen nå også i 384, tilbyr noen valg for store vekst og screening. Dette observert gapet har ført til utviklingen av metodene som er beskrevet her i detalj til kultur svulst spheroids i en høy gjennomstrømming kapasitet i 1536-og plater. Disse metodene representerer et kompromiss til komplekse matrix-baserte systemer, som er vanskelig å skjermen og konvensjonelle 2D analyser. En rekke kreftcelle linjer huse forskjellige genetiske mutasjoner er vellykket screenet, undersøke sammensatte effekt ved hjelp av et kuratert bibliotek av forbindelser målretting Mitogen-Activated Protein Kinase eller MAPK veien. Spheroid kultur svarene er deretter sammenlignet med responsen av celler dyrket i 2D, og differensial aktiviteter blir rapportert. Disse metodene gir en unik protokoll for testing sammensatt aktivitet i høy gjennomstrømming 3D omgivelser.
Introduction
I det siste tiåret, har flere og flere studier implementert bruk av 3D celle kultur modeller å forstå begreper som ikke er fullt recapitulated av voksende celler i 2D på plast. Eksempler på disse begrepene er alternations i normal epithelial celle polaritet1 hvor den romlig orienteringen av apikale og basal lag av celler som er tapt, i tillegg til rollen den ekstracellulære matrisen i å regulere overlevelse og celle skjebne. Onkologi research, spesielt har brukt 3D modeller for å forstå grunnleggende biologi kreftceller og forskjellene mellom 2D og 3D celle kultur systemer3,4. Utviklingen av mer sofistikert celle kultur teknikker og deres ytterligere tilpasning til flere godt formater har aktivert Søk etter nye stoffer i 3D innstillinger. I motsetning til celler dyrket vilkår 2D, 3D-modeller av svulster varierer i kompleksitet fra lagdelte cellulær systemer5 til single-celle-type sfærer av forskjellige størrelser, til komplekse multi-cell-type kuler6,7, 8. oppdagelsen av romanen forbindelser eller biologiske som potently indusere celledød i systemene 3D-modellen er derfor høy interesse for narkotika utvikling kampanjer. Endepunktene på disse analyser er ofte identisk med de i 2D kulturer å vurdere endringer i celle spredning, men når gjennomført i en mer fysiologisk innstillingen, de kan avdekke sant nivået av avhengighet av målet genet eller veien blir avhørt.
Som introdusert over, en rekke modellsystemer er utviklet for å studere medikament reaksjoner i 3D kultur systemer, men fleste bruker enten 96 eller 384-vel være ferdig innen plater og er ikke lett tilpasses til høy gjennomstrømming screening (HTS) formater ofte brukt i Drug discovery screening kampanjer. Slike systemer inkluderer bruk av hengende slippverktøy teknologier, formet kulturer, pulserende celler med magnetiske partikler å indusere levitation og kulturer omfatter naturlige eller syntetiske gels som kollagen, Matrigel eller polyetylenglykol (PEG)2 . Her presenterer vi detaljerte metoder for en tidligere utviklet teknikk for å produsere 3D-formet kulturer fra etablerte kreftcelle linjer i 1536-vel plate format. I denne protokollen brukes en svært definerte medium som hindrer feste normalt tilhenger cellen linjer9. Dette systemet har begrensninger (dvs.den ikke fullt recapitulate et kompleks system av kreft), men likevel disse analyser aktivere en høy gjennomstrømming screening av store samlinger av små molekyler og tverrgående sammenligninger av narkotika-respons mellom 2D og 3D kulturer mot en rekke linjer og forbindelser.
Cellelinjer valgt for å demonstrere metodene i denne artikkelen alle harbor mutasjoner i gener knyttet til MAPK signalveien, en sti som er svært dysregulated i kreft, og som mange therapeutics er tilgjengelig. Mye av det har aktiveringen kreftfremkallende mutasjoner i Kirsten rotte sarkomspesialitet viruset også referert til som KRAS, neuroblastom RAS eller NRAS, Harvey rotte sarkomspesialitet virus oncogene eller HRAS og de tilknyttede kinaser raskt akselerert Fibrosarcomas, også kjent som RAFs. Litteraturen antyder at hemmere av forskjellige noder av denne veien er unikt mer effektiv i et delsett av cellen linjene når dyrket under 3D forhold9,10. En studie fant at når celler med aktive RAS ble kultivert i 3D, de viste en økt følsomhet for MAPK hemmere, og videre at denne tilnærmingen kan identifisere veier og målrettet hemmere som kunne være savnet i tradisjonelle 2D innstilling. Målet med denne studien er å presentere metoder brukt for å kultur disse linjer, og videre, for å demonstrere differensial Svar å disse hemmere som kan observeres bare når du bruker 3D celle kultur systemer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metodene presenteres her viser en detaljert protokoll om hvordan å lage svulst spheroids i 1536-vel plater for store sammensatte screenings. Disse metodene ble opprinnelig tilpasset fra arbeid på National Cancer Institute hvor svulst spheroids ble dyrket i lav gjennomstrømming analyser i 6-vel og 96-brønns plater å stille spørsmål om genetisk avhengigheter og sammensatte følsomhet13, 14 , 15. en kritisk og unike funksjon…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å erkjenne Marc Ferrer ved National Center for fremme translasjonsforskning Sciences, National Institutes of Health for hans støtte og veiledning om den første utviklingen av disse analyser. I tillegg vil vi gjerne takke Alyson Freeman, Mariela Jaskelioff, Michael Acker, Jacob Haling og Vesselina Cooke for sine vitenskapelige inngang og diskusjon som gruppemedlemmer.
Materials
| Reagents | |||
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | ATCC | 30-2006 | Purchased as a prepared solution. This reciepe was found to be preferred compared to other vendors. |
| DMEM Dulbecco`s Modified Eagle Media (DMEM)/F12 | Lonza | 12-604F | Purchased as a prepared solution. |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Lonza | 12-115Q | Purchased as a prepared solution. |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-500 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x 0.25% Trypsin with Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Hyclone | SH30042.01 | Purchased as a prepared solution. |
| 1x Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | Purchased as a prepared solution. |
| 10 ng/mL Human basic Fibrobast Growth Factor (bFGF) | Sigma | F0291 | Resuspend in sterile water. |
| 20 ng/mL Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644 | Resuspend in sterile water. |
| 0.4% Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418 | Resuspend in sterile PBS and filter. |
| 1x Insulin Transferrin Selenium (ITS) | Gibco | 51500056 | |
| 1% KnockOut (KO) Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | Add fresh right before use. |
| 100% Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | |
| CellTiter-Glo | Promega | G7573 | Purchased as a prepared solution. |
| Consumables | |||
| Small Combi Cassette | ThermoFisher | 24073295 | |
| Small Multiflow Cassette | BioTek | 294085 | |
| 1536-well sterile TC plates (white) | Corning | 3727 | |
| 1536-well sterile TC plates (black) | Corning | 3893 | |
| Scivax Plates | MBL International | NCP-LH384-10 | |
| Equipment | |||
| Adhesives seals | ThermoFisher | AB0718 | |
| Spinning Incubator | LiCONiC | ||
| Stainless Steel Lids | The Genomics Institute of Novartis Research Foundation (GNF) | ||
| ATS Acoustic Dispensor | EDS Biosystems | ||
| Echo Acoustic Dispensor | Labcyte | ||
| Luminometer | Envision-Perkin Elmer | ||
| Peristaltic Pump- Multidrop Combi | ThermoFisher | ||
| Liquid Handler-Multiflow FX | BioTek |
Referências
- Lee, M., Vasioukhin, V. Cell polarity and cancer–cell and tissue polarity as a non-canonical tumor suppressor. Journal of Cell Science. 121 (Pt 8), 1141-1150 (2008).
- Nath, S., Devi, G. R. Three-dimensional culture systems in cancer research: Focus on tumor spheroid model. Pharmacology & Therapeutics. 163, 94-108 (2016).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69, 42-51 (2014).
- Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 332 (3), 821-828 (2010).
- Li, L., Lu, Y. Optimizing a 3D Culture System to Study the Interaction between Epithelial Breast Cancer and Its Surrounding Fibroblasts. Journal of Cancer. 2, 458-466 (2011).
- Pickl, M., Ries, C. H. Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab. Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).
- Nyga, A., Cheema, U., Loizidou, M. 3D tumour models: novel in vitro approaches to cancer studies. Journal of Cell Communication and Signaling. 5 (3), 239-248 (2011).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: an update. Molecular Carcinogenesis. 52 (3), 167-182 (2013).
- Mathews Griner, L. A., et al. Large-scale pharmacological profiling of 3D tumor models of cancer cells. Cell Death & Disease. 7 (12), e2492 (2016).
- Polo, M. L., et al. Responsiveness to PI3K and MEK inhibitors in breast cancer. Use of a 3D culture system to study pathways related to hormone independence in mice. PLoS One. 5 (5), e10786 (2010).
- Hatzivassiliou, G., et al. RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Nature. 464 (7287), 431-435 (2010).
- Bhargava, A., et al. Registered report: RAF inhibitors prime wild-type RAF to activate the MAPK pathway and enhance growth. Elife. 5, e09976 (2016).
- Mathews, L. A., Hurt, E. M., Zhang, X., Farrar, W. L. Epigenetic regulation of CpG promoter methylation in invasive prostate cancer cells. Molecular Cancer. 9, 267 (2010).
- Mathews, L. A., Crea, F., Farrar, W. L. Epigenetic gene regulation in stem cells and correlation to cancer. Differentiation. 78 (1), 1-17 (2009).
- Mathews, L. A., et al. Increased expression of DNA repair genes in invasive human pancreatic cancer cells. Pancreas. 40 (5), 730-739 (2011).
- Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
- Horii, T., Nagao, Y., Tokunaga, T., Imai, H. Serum-free culture of murine primordial germ cells and embryonic germ cells. Theriogenology. 59 (5-6), 1257-1264 (2003).
- Sun, L., et al. Epigenetic regulation of SOX9 by the NF-kappaB signaling pathway in pancreatic cancer stem cells. Stem Cells. 31 (8), 1454-1466 (2013).
- Mathews, L. A., et al. A 1536-well quantitative high-throughput screen to identify compounds targeting cancer stem cells. Journal of Biomolecular Screening. 17 (9), 1231-1242 (2012).
- Mathews Griner, L. A., et al. High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).
- Herter, S., et al. A novel three-dimensional heterotypic spheroid model for the assessment of the activity of cancer immunotherapy agents. Cancer Immunology, Immunotherapy. 66 (1), 129-140 (2017).
