我们提供了一步一步的协议为分裂-BioID, 一种蛋白质片段互补试验的基础上的接近标记技术 BioID。激活在两个给定的蛋白质的相互作用, 它允许蛋白质组学分析的上下文相关的蛋白质复合物在他们的本机细胞环境。该方法简单, 成本效益高, 只需要标准的实验室设备。
为了补充现有的亲和纯化 (AP) 方法, 以确定蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI), 已经引入酶, 允许接近相关的标签蛋白质在活细胞。一种这种酶, 比拉 * (用于 BioID 方法), 介导蛋白质的 biotinylation 在大约10毫微米范围内。因此, 当融合到一个感兴趣的蛋白质, 并表达在细胞, 它允许标签的近端蛋白在其本土环境。与依赖于组装蛋白复合物纯化的 AP 相反, BioID 检测在细胞中被标记的蛋白质, 无论它们是否仍然与它们在分离时的兴趣蛋白相互作用。由于它 biotinylates 近端蛋白质, 你可以而且利用链亲和素的特殊亲和性, 以非常有效地分离它们。虽然 BioID 在识别瞬态或弱相互作用方面表现优于 ap, 但 ap 和 BioID 质谱方法都提供了一种已知蛋白质可能的相互作用的概述。但是, 它们不提供有关每个已确定 PPI 的上下文的信息。事实上, 大多数蛋白质通常是几个复合体的一部分, 对应于不同的成熟步骤或不同的功能单元。为了解决这两种方法的共同局限性, 我们设计了一种基于比拉酶的蛋白质片段互补试验。在这项试验中, 两个非活性片段的比拉 * 可以重组成一个活跃的酶, 当接近接近由两个相互作用的蛋白质, 他们被融合。由此产生的分裂-BioID 的检测, 从而允许标签的蛋白质, 聚集在一对相互作用的蛋白质。如果这两个仅在给定的上下文中进行交互, 则 BioID 将允许对其本地蜂窝环境中特定的上下文相关功能单元进行分析。在这里, 我们提供了一步一步的协议, 以测试和应用分裂 BioID 的一对相互作用的蛋白质。
由于大多数细胞功能是由动态组装大分子络合物的蛋白质进行的, 蛋白质相互作用的鉴定是生物医学研究中的一项重要努力。事实上, PPI 在疾病中经常被解除管制, 并代表治疗1的潜在目标。PPI 鉴别的最广泛使用的方法是亲和纯化 (AP) 方法, 在细胞裂解后, 一种感兴趣的蛋白质被专门纯化在基质上, 相关蛋白随后通过质谱鉴定(MS)。虽然 AP MS 是一个强有力的方法, 它通常不会表现良好的可溶性蛋白复合物, 非常短暂的相互作用或 PPI, 需要一个完整的亚细胞结构。而且, 由于 PPI 网络的动态特性, 对数据的解释可能会很复杂, 因为单个蛋白质通常是几个不同蛋白质复合体的一部分。
最近开发了接近标记技术, 如 BioID2或 APEX23、4 , 以解决 AP MS 方法的一些局限性。在 BioID, 酶比拉 * (对应于野生类型的大肠杆菌酶的 G115R 变种) 催化形成的不稳定的 biotinyl 安培 (生物放大器), 可以与初级胺反应。相对于野生型酶, 它保留生物安培在其活跃的中心, 比拉 * 释放生物放大器允许其扩散到其邻近的环境。因此, 当融合到一个感兴趣的蛋白质, 并表达在细胞, 近端蛋白可以生物素化在估计范围内 10毫微米5。这些标记的近端蛋白质然后被链亲和素下拉和由 MS 辨认。与 AP MS 相反, BioID 需要融合蛋白的表达。因此, 它只能适用于功能不受标签限制的蛋白质。此外, 标签速度很慢, 通常 6–24 h2,6, 使得检测短寿命蛋白质具有挑战性。然而, 与 AP ms 相比, BioID 提供了几个关键优势: 首先, 它捕捉到了其本地细胞环境中的相互作用;第二, 细胞裂解后分离出标记蛋白而非组装复合物;第三, 链亲和素 pulldowns 允许使用变性缓冲器和苛刻的洗涤条件。因此, 该方法对于检测瞬态或弱交互7或发生在特定和难以隔离亚细胞结构8上的交互更敏感。
然而, 大多数蛋白质通常是较大的复合体的一部分, 可以根据细胞的暗示或需要执行的功能进行改造。因此, 单个蛋白质通常是几个配合物的一部分, 对应于不同的功能单位, 涉及不同的和/或重叠的 PPI。这两种方法都概述了给定蛋白质可能具有的所有关联, 但它们未能解决单个 PPI 的上下文。为了增加后者的分辨率, 我们设计了一种蛋白质片段互补试验 (PCA), 其中两个不活跃的比拉 * (NBirA *, 包含催化领域, CBirA *, 可以被视为重新激活域) 可以当两种相互作用的蛋白质在接近的接近度时, 重新组装成活性酶9。由此产生的分裂-BioID 检测聚焦于接近依赖的 biotinylation 蛋白质, 聚集在一对相互作用的蛋白质, 从而允许识别上下文相关的蛋白质组件。最近, 我们通过解决 miRNA 介导的基因沉默通路9中的两个不同的蛋白质复合体, 证明了 BioID 的杰出分辨力。
总之, 在一个单一和简单的检测, 分裂-BioID 允许发现和具体分配 PPI 到定义的功能单位, 其中一个特定的蛋白质, 提供一个额外的互动蛋白的相应的蛋白质复合体已知。
概述了如何将感兴趣的基因克隆到分裂-BioID 质粒中, 如何检测相互作用诱发的 biotinylation, 以及如何分离生物素化蛋白进行质量谱分析。这里我们描述了一个基于瞬变转染的过程。虽然融合蛋白的表达可以通过添加到培养基中的 dox 量来调节, 但当与内源性相比, 瞬变转染可能导致与某些细胞严重过度表达 tshr 融合蛋白的非同源蛋白表达。同行。这可能会导致相应的 interactomes 和 PPI 的扭曲, 不忠实地反映涉及内源性蛋白质的相互作用。因此, 在瞬态系统建立 BioID 后, 一般都应该构造稳定的细胞系。该质粒与 Flp 介导的重组系统相容, 并将两个感兴趣的基因置于同一种应答元素的调节之下。如果需要, 并且当使用与兼容哺乳动物细胞, 他们允许容易地创造稳定的诱导细胞线。例如, 我们使用 HeLa-EM2-11 线表达 rtTA 四环素激活转录激活剂和一个独特的多弹头基因组位点, 其中四环素介导的基因表达可以严格调节12。使用这一细胞线和 Flp 介导的重组, 仅含有一份转基因的稳定细胞系可以在2/3 周内获得。或者, 你也可以使用目前的基因组编辑技术, 在基因的原生基因座中引入比拉片段。
在任何依赖于标记蛋白质的化验中, 人们都需要考虑所产生的融合蛋白是否起作用。有兴趣的蛋白质被标记的可利用的数据 (例如与 GFP 为成像研究) 和功能上被测试是有用的决定是否应该克隆比拉的片断在上游或下游基因感兴趣。如果没有此类数据, 则应在功能检测中测试 n-末期或 c-末期标记蛋白。例如, 融合蛋白的活性可以在细胞系中进行检测, 其中内源蛋白已被淘汰, 并与野生类型的情况进行比较。如果兴趣的蛋白质容忍 N 和 C 终端标记, 两个应该被测试。事实上, 在 BioID 实验中, 融合蛋白的定位会影响标记22的效率。此外, 我们观察到, 当对一对蛋白质应用分裂 BioID 时, 两种蛋白质中的哪一种被追加到 NBirA * 或 CBirA * 片段也会影响标记9的效率。在分裂-BioID 质粒, 16 氨基酸长甘氨酸/丝氨酸丰富的连接器耦合蛋白质的比拉 * 片段取自另一个 PCA 23, 并为我们的所有相互作用的蛋白质, 我们已经测试到目前为止.然而, 人们应该认为, 一些蛋白质对可能会更好地使用较短或更长的连接器。最后说明中, 博伦组24描述了另一种检测方法。在这种化验中, 比拉 * 是分裂在另一个地点 (E140/Q141) 比我们 (E256/G257)。我们同时测试了两种分离 BioID 的风味, 发现在本协议中描述的 E256/G257 在耦合到两个相互作用的蛋白质9时会导致更强的重新激活。
这种方法的一个一般缺点是标签速度慢。通常, 6 到24小时的孵化时间与生物素是必要的, 以获得可观的 biotinylation6, 排除使用此技术研究动态重塑的蛋白质复合物。虽然这一分析部分解决了这一告诫, 因为它只在两种蛋白质相互作用的情况下激活, 标签的缓慢速度排除了它用于研究对非常动态过程的反应或分析短寿命蛋白质。工程过氧化物酶 APEX2 是已知的促进有效标记近端蛋白在1分钟3。因此, 基于 APEX2 的 PCA 可以解决 BioID 的检测速度慢的局限性。一项原则证明研究描述了这种 split-APEX2 化验25。然而, 虽然 homodimerizing 蛋白是成功地生物素化, 是否也可以用于标签和识别蛋白质组装周围的一对相互作用的蛋白质仍有待证明。最近, 定向进化被用来创建 TurboID 和 miniTurbo, 两个变体的比拉 * 与增强的活动, 允许更短的标签时间窗口, 降低到10分钟26。将 BioID 与这些新变体相适应将进一步将此技术应用于更广泛的应用领域。
The authors have nothing to disclose.
这项工作由德国研究理事会 (DFG) 通过德国卓越倡议 (CellNetworks DFG-激动 81) 资助, 并由合作研究中心 SFB638 提供部分资金。
Acetic acid (glacial) | VWR | 20104.298 | To make TAE buffer |
Agarose | Sigma | A9539 | Take TAE-agarose gels for DNA analysis and extraction |
Ammonia solution 25% NH3 | Bernd Kraft | 6012 | To dissolve biotin |
Ampicillin | Sigma | A9518 | To select transformed bacteria |
Bioruptor plus sonification device | Diagenode | B01020001 | Other sonification devices are also ok |
Biotin | Sigma | B4639 | To be added to the growth medium to stimulate efficient biotinylation |
Bovine serum albumin fraction V | Carl Roth | 8076 | Used in Western blot buffers and a protein standard in Bradford assays |
Bradford Ultra reagent | Expedeon | BFU05L | Any other method/kit for protein determination is fine, this particular reagent is more tolerant to detergent than other Bradford reagents |
Cell scrappers | TPP | 99002 | Any other model is also fine |
ClaI | New England Biolabs | R0197 | Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion) |
DMEM medium | Sigma | D6046 | If using another cell line, use the corresponding optimal growth medium |
DNA miniprep kit | Sigma | PLN350 | Any other kit is also fine |
Doxycycline | Applichem | A2951 | Dox is light sensitive |
DTT | Applichem | A2948 | Make 1M stock solution, store at -20 °C and always use fresh |
DyLight 680-conjugated streptavidin | Thermo scientific | 21848 | to use with a LiCor Western blot scanning device |
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65002 | The C1 beads are not BSA coated which is preferable for downstream MS applications (no leakthrough of BSA in the final elution) |
EDTA | Applichem | A5097 | Make a 500 mM stock, adjust pH to 8 while dissolving the EDTA powder |
Ethanol | Sigma | 32205 | Make a 70% stock solution in which Doxycycline can be dissolved at 10 mg.mL-1 |
Fastgene Gel/PCR DNA Extraction Kit | Nippon Genetics | FG-91302 | Any other kit is also fine |
HCl 37% | Merck | 1.00317.1000 | To adjust pH of biotin stock solution |
HEPES | Carl Roth | 6763 | Make a 500 mM stock solution, adjust the pH to 7.4 |
Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45 µm | Millipore | IPFL00010 | This membrane shows minimal autofluorescence when used with a LiCor Western blot scanning device |
LiCl | Grüssing GmbH | 12083 | Make a 5M stock solution |
Odyssey CLx imaging system | LI-COR | N/A | To scan Western blot membrane decorated with fluorophore-labeled antibody |
Linear polyethylenimine (PEI) | Polysciences | 23966-2 | Any other transfection reagent is also fine |
Milk powder | Carl Roth | T145 | To block Western blot membranes |
MluI-HF | New England Biolabs | R3198 | Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion) |
Na-deoxycholate | Sigma | 30970 | Make a 10% (w/v) stock solution |
NaCl | Sigma | 31434 | Make a 5M stock solution |
NP-40 (Nonidet P40 substitute) | Sigma | 74385 | Make a 20% (v/v) stock solution |
PacI | New England Biolabs | R0547 | Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion) |
Phosphate buffer saline (PBS) | Sigma | 806552 | To wash cells before scrapping |
PmeI | New England Biolabs | R0560 | Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion) |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 4693132001 | Added to the lysis buffer to prevent protein degradation |
pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP | Addgene | 90003 | Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs |
pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir | Addgene | 90004 | Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs |
pSF3-Flag-FRB-Cbir_Myc-NBir-FKBP | Addgene | 90008 | Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs |
pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir | Addgene | 90009 | Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs |
Q5 High-Fidelity PCR kit | New England Biolabs | E0555S | To amplify the ORF coding for the proteins to be tested. Any other thermostable DNA polymerase is fine. |
Quick ligation kit | New England Biolabs | M2200S | To ligate DNA fragments into the split-BioID plasmids, any other DNA ligation system is fine. |
RunBlue 4-20% SDS precast gels | Expedeon | BCG42012 | To use when running samples for MS analysis |
RunBlue LDS Sample Buffer | Expedeon | NXB31010 | Running buffer for the RunBlue precast gels |
SDS | Sigma | 5030 | Comes as a 20% stock solution |
tet-free serum | Biowest | S181T | we use tet-free serum to minimize basal expression of the fusion proteins |
Trans-Blot Turbo Transfer system | Bio-Rad | 1704150 | High speed Western blotting transfer system, any other transfer system is also fine |
Tris | Carl Roth | 4855 | Make 1M stock solutions with adequate pH (7.4 and 8) |
Triton X-100 | Applichem | A4975 | Make a 20% (v/v) stock solution |
Tween-20 | Carl Roth | 9127 | Used in Western blot buffers, Tween 20 leads to high background fluorescence and should be omitted in the blocking and last wash step |