Musculus levator Auris Longus Voorbereiding onderzoek van zoogdieren neuromusculaire transmissie Voltage Clamp voorwaarden
Summary
Het protocol beschreven in dit document maakt gebruik van de muis Musculus levator auris longus (LAL) spier graag spontane, zenuw-opgeroepen postsynaptisch potentieel (current-clamp) en stromingen (spanning-klem) op de motorische eindplaat. Gebruik van deze techniek kan belangrijke inzicht verwerven in de mechanismen van synaptische transmissie onder normale en zieke voorwaarden.
Abstract
Dit protocol beschrijft een techniek naar record synaptische transmissie van de motorische eindplaat current-clamp en spanning-clamp voorwaarden. Een ex vivo -voorbereiding van de Musculus levator auris longus (LAL) wordt gebruikt omdat het is een dunne spier die gemakkelijke visualisatie van de motorische eindplaat micro-elektrode Spietsing op de motorische eindplaat voorziet. Deze methode zorgt voor de opname van de spontane miniatuur eindplaat potentials en stromingen (mEPPs en mEPCs), eindplaat zenuw-evoked potentials en stromingen (EPPs en Spoon), evenals de eigenschappen van de membraan van de motorische eindplaat. Deze methode verkregen resultaten omvatten de quantal inhoud (QC), aantal vesikel release sites (n), de waarschijnlijkheid van het vesikel release (prel), synaptic versoepeling en depressie, evenals de tijdconstante van de spier-membraan (τ m) en de inbreng van de weerstand. Toepassing van deze techniek te Muismodellen van ziekten bij de mens kan markeren belangrijkste pathologieën in ziekte staten en helpen bij het identificeren van de roman behandelingsstrategieën. Deze methode biedt door volledig spanning-klemmen een enkele SYNAPS, een van de meest gedetailleerde analyses van de synaptische transmissie momenteel beschikbaar.
Introduction
Bestuderen van synaptische transmissie op de motorische eindplaat biedt inzichten in de dynamische relatie tussen de gespierde nerveus en skelet-systemen en is een uitstekend model voor de behandeling van synaptic fysiologie. De Musculus levator auris longus (LAL) is een dunne spier, waardoor de neuromusculaire kruispunten te gemakkelijk worden gevisualiseerd. Eerdere verslagen hebben omschreven het gemak van het gebruik van de LAL synaptic drugs en toxine te onderzoeken en het skelet spiervezel type Eigenschappenvan de LAL1,2hebben gekenmerkt. Talrijke studies hebben de LAL gebruikt om te onderzoeken van de neuromusculaire fysiologie3,4,5,6,7,8. Voor electrofysiologie, de mogelijkheid om eenvoudig observeren LAL neuromusculaire kruispunten voorziet in de nauwkeurige plaatsing van microelectrodes in de motorische eindplaat en sterk vermindert ruimte klem kwesties in de opname van de synaptische transmissie. Current-clamp opnames van de spier membraan eigenschappen, zoals de membraan tijdconstante (τm) en de input weerstand (Rde) zijn gemakkelijk verkregen. Bovendien kunnen deze eigenschappen worden gemeten vanaf de dezelfde spiervezels gebruikt voor de registratie van de neuromusculaire transmissie, waardoor een directe vergelijking van synaptische functie aan de eigenschappen van de spier-membraan. Analyse van deze gegevens kan belangrijke inzicht verwerven in de fysische mechanismen van veel neuromusculaire ziekten en Staten van gewijzigde activiteit.
Een belangrijk aspect van de hier beschreven techniek is het gebruik van spanning-clamp voor synaptic opnamen, die zijn niet onderworpen aan de niet-lineariteiten ondervonden in current-clamp en zijn onafhankelijk van de eigenschappen van de spier-membraan. Voordelen van het gebruik in tegenstelling tot huidige-klem-spanning-klem te onderzoeken van de neuromusculaire transmissie zijn vastgesteld door de baanbrekende inspanningen in de jaren 1950-9. Onder huidige-clamp zijn EPPs die hoger zijn dan 10-15 mV in amplitude niet een lineaire product van de waterwerkgroep amplitude9. Bijvoorbeeld, als de gemiddelde waterwerkgroep is 1 mV, een EVP van 5 mV kan worden aangenomen dat het product van 5 mEPPs (QC 5); Overwegende dat een EVP van 40 mV zullen het product van meer dan 40 mEPPs. Deze niet-lineariteit op grotere EPPs treedt op omdat de drijvende kracht voor het EPP-programma, dat is het verschil tussen de membraanpotentiaal en evenwicht potentieel voor de acetylcholine receptor (~ -10 mV), aanzienlijk verlaagt tijdens grote EPPs. Dit probleem is in spanning-clamp experimenten vermeden omdat de membraanpotentiaal spier niet tijdens spanning-clamp experimenten verandert. Een nadeel is dat spanning-clamp experimenten technisch moeilijker zijn te voltooien dan current-clamp opname. Met dit in gedachten ontwikkeld McLachlan en Martin een eenvoudige wiskundige correctie die goed is voor niet-lineariteiten in current-clamp opnames van EPPs10. De correcties werken goed11,12,13, maar nog belangrijker is, veronderstellen dat de spier membraan eigenschappen hebben niet verstoord.
De spier membraan eigenschappen zijn met name belangrijk om te overwegen als studeren voorwaarden of ziekte staten die verstoren van de spier. Skeletspieren van de R6/2 transgene model van de ziekte van Huntington is bijvoorbeeld hyperexcitable als gevolg van een geleidelijke vermindering in de rust chloride en kalium stromingen14,15. Dientengevolge, worden mEPPs en EPPs versterkt in de skeletspieren R6/2. Bijkomende factoren kunnen zeker, mEPPs en EPPs wijzigen. Werken met een ander model van de ziekte van Huntington muizen (R6/1) wijzigingen in EPPs dat leek te worden gerelateerd aan SNARE-eiwitten8gevonden. Om te beoordelen de mechanismen waardoor veranderde neuromusculaire transmissie, zou het zinvol zijn om te elimineren van de effecten van de eigenschappen van de membraan van de gewijzigde spier met behulp van een spanning-klem. In een recente studie, werd de R6/2 neuromusculaire transmissie bestudeerd onder beide stroom en spanning-kogelklem voorwaarden hierin met behulp van de techniek beschreven. Het geheel van de motor endplates waren spanning-geklemd met minder dan 1% fout door het plaatsen van twee microelectrodes binnen de constante van de lengte van de eindplaat16. Het bleek dat spanning-clamp en current-clamp records opgeleverd contrasterende metingen van neuromusculaire transmissie in R6/2 spier gecorrigeerd. Dit benadrukt dat het wellicht moeilijk te corrigeren EPPs voor niet-lineariteiten als de spier membraan eigenschappen zijn gewijzigd en toont de voordelen van het verkrijgen van de spanning-clamp records die onafhankelijk van de eigenschappen van de spier-membraan zijn. Het protocol gepresenteerd hierin is ideaal voor de behandeling van de voorwaarden of ziekte staten die invloed hebben op de synaptische transmissie en de eigenschappen van het postsynaptisch membraan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreven is de voorbereiding en het gebruik van de muis LAL spier voor de meting van de neuromusculaire transmissie onder stroom – of spanning-clamp voorwaarden. Er zijn verschillende belangrijke punten om te overwegen voor het ontleden van de LAL. Reiniging van overtollige bindweefsel van de spier aids in elektrode Spietsing, als de elektroden kunt addertje onder het gras het bindweefsel wanneer ze voor Spietsing positionering. Echter alleen het verwijderen van bindweefsel die kan worden ontnomen gemakkelijk te b…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Mark M. Rich en Daniel Miranda voor redactiecommentaren, Ahmad Khedraki voor het helpen vaststellen van deze techniek en Wright State University voor financiële steun (opstarten Fonds A.A.V.).
Materials
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Axoclamp 900A Amplifier | Molecular Devices | 2500‐0179 | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher | |
Referências
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
- Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
- Bertone, N. I., et al. Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction. Synapse. , (2017).
- Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release. J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
- Nadal, L., et al. Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction. Mol Brain. 9 (1), 67 (2016).
- Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties. Neurociência. 167 (3), 621-632 (2010).
- Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease. J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).
- Takeuchi, A., Takeuchi, N. Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current. J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).
- McLachlan, E. M., Martin, A. R. Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse. The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).
- Obis, T., et al. The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction. Mol Brain. 8 (1), 80 (2015).
- Silveira, P. E., et al. Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction. Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).
- Wood, S. J., Slater, C. R. Safety factor at the neuromuscular junction. Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).
- Miranda, D. R., et al. Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington’s mice. J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).
- Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).
- Khedraki, A., et al. Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington’s Disease Neuromuscular Junctions. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).
- Greene, E. C. . The anatomy of the rat. , (1955).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent probes that stain living nerve terminals. J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. . Electric current flow in excitable cells. , (1983).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors. Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).
- Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. Fast and slow mammalian muscles after denervation. Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).
- Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals. Neurociência. 95 (1), 227-234 (2000).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin. J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).
- Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis. Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).
