Levator Auris Longus Prüfungsvorbereitung der Säugetier-neuromuskulären Übertragung unter Spannung Klemme Bedingungen
Summary
Das Protokoll in diesem Dokument beschriebenen verwendet die Maus Levator Auris Longus (LAL) Muskeln, um spontan aufnehmen und Nerv-evozierten postsynaptischen Potenziale (Strom-Klemme) und Ströme (Voltage-Clamp) an der neuromuskulären Synapse. Diese Technik können wichtige Einblicke in die Mechanismen der synaptischen Übertragung unter normalen und Krankheit darstellen.
Abstract
Dieses Protokoll beschreibt eine Technik zur Aufzeichnung synaptische Übertragung aus der neuromuskulären Synapse unter Strom-Klemme und Spannung-Klemme. Eine ex-Vivo -Vorbereitung des Levator Auris Longus (LAL) wird verwendet, weil es eine dünne Muskel ist, der einfache Visualisierung von der neuromuskulären Synapse Mikroelektrode Impalement an der motorischen Endplatte vorsieht. Diese Methode ermöglicht die Aufzeichnung von spontanen Miniatur Endplatte Potentiale und Ströme (mEPPs und mEPCs), Endplatte Nerv-evozierten Potentiale und Ströme (EPPs und EPCs), sowie die Eigenschaften der Membran der motorischen Endplatte. Ergebnisse, die von dieser Methode auch die Quanten Inhalte (QC), Anzahl der Vesikel freisetzungsstandorten (n), Wahrscheinlichkeit des vesikels Release (pRel), synaptische Erleichterung und Depression sowie Muskel-Membran-Zeitkonstante (τ m) und Eingangswiderstand. Anwendung dieser Technik zu Mausmodellen menschlicher Erkrankungen kann wichtige Pathologien bei Krankheitszuständen markieren und identifizieren neue Behandlungsstrategien. Klemmend voll Spannung-eine einzige Synapse, stellt diese Methode eine der ausführlichsten Analysen der synaptischen Übertragung derzeit verfügbar.
Introduction
Studium der synaptischen Übertragung an der neuromuskulären Synapse bietet Einblicke in die dynamische Beziehung zwischen dem Nerven- und Skelett-Muskelsystem und ist ein hervorragendes Modell für die Prüfung von synaptischen Physiologie. Die Levator Auris Longus (LAL) ist eine dünne Muskel, so dass für die neuromuskulären Verbindungen leicht visualisiert werden. Frühere Berichten haben die Bequemlichkeit der Nutzung der LAL, synaptische Drogen und Giftstoffe zu untersuchen und charakterisiert die skelettartigen Muskel Faser Art Eigenschaften des LAL1,2beschrieben. Zahlreiche Studien haben die LAL verwendet, um neuromuskuläre Physiologie3,4,5,6,7,8zu untersuchen. Für Elektrophysiologie die Fähigkeit, LAL neuromuskuläre Kreuzungen leicht beobachten ermöglicht die genaue Platzierung von Mikroelektroden an der motorischen Endplatte und Klemme Platzprobleme in der synaptischen Übertragung Aufnahme reduziert. Strom-Clamp Aufnahmen der Muskel Membran Eigenschaften, wie die Membran Zeitkonstante (τm) und Eingangswiderstand (Rde) werden leicht erreicht. Darüber hinaus können diese Eigenschaften von den gleichen Muskelfasern zur Aufzeichnung der neuromuskulären Übertragung, so dass ein direkter Vergleich der synaptischen Funktion an den Muskel-Membran-Eigenschaften verwendet gemessen werden. Analyse dieser Daten liefern wichtige Erkenntnisse über die physikalischen Mechanismen der vielen neuromuskulären Erkrankungen und Zustände der veränderte Aktivität.
Ein wichtiger Aspekt der hier beschriebenen Technik ist die Verwendung der Spannung-Klemme für synaptische Aufnahmen, die nicht unterliegen die Nichtlinearitäten im Strom-Clamp begegnet und sind unabhängig von der Muskel-Membran-Eigenschaften. Vorteile der Verwendung von Voltage-Clamp im Gegensatz zu Strom-Clamp, um neuromuskulären Übertragung zu untersuchen wurden von bahnbrechenden Bemühungen in den 1950er Jahren9eingerichtet. Unter Strom-Clamp sind EPPs, die 10-15 mV Amplitude überschreiten keine lineare Produkt der Nahostfriedensprozess Amplitude9. Zum Beispiel, wenn die durchschnittliche Nahostfriedensprozess 1 mV, einem EVP von 5 mV kann davon ausgegangen werden, das Produkt von 5 mEPPs (QC 5); in der Erwägung, eine EVP von 40 mV wird das Produkt von mehr als 40 mEPPs sein. Diese nicht-Linearität bei größeren EPPs tritt auf, weil die treibende Kraft für die EVP, was ist der Unterschied zwischen der Membran und Gleichgewicht-Potenzial für den Acetylcholin-Rezeptor (~-10 mV), erheblich sinkt, während große EPPs. Dieses Problem wird in Voltage-Clamp-Experimenten vermieden, weil der Muskel Membran Potenzial während Voltage-Clamp-Experimenten nicht ändert. Ein Nachteil ist, dass Spannung-Clamp Experimente sind technisch schwieriger als Strom-Clamp Aufnahme. Mit diesem im Verstand entwickelt McLachlan und Martin eine einfache mathematische Korrektur, die Nichtlinearitäten im Strom-Clamp Aufnahmen von EPPs10ausmacht. Die Korrekturen funktionieren gut11,12,13, aber wichtiger ist, davon ausgehen, dass die Muskel-Membran-Eigenschaften wurden nicht gestört.
Die Muskel-Membran-Eigenschaften sind besonders wichtig zu prüfen, ob Studium der Bedingungen oder Krankheitszuständen, die den Muskel zu stören. Skelettartiger Muskel aus dem R6/2 transgenen Modell der Huntington-Krankheit ist beispielsweise übererregbar durch eine schrittweise Verringerung der ruhenden Chlorid und Kalium Ströme14,15. Infolgedessen sind mEPPs und EPPs in der Skelettmuskulatur R6/2 verstärkt. Natürlich können zusätzliche Faktoren mEPPs und EPPs ändern. Arbeiten Sie mit einem anderen Modell von Chorea Huntington Mäusen (R6/1) Änderungen in EPPs, die im Zusammenhang mit SNARE-Proteine8schien gefunden. Um die Mechanismen, die veränderten neuromuskulären Übertragung zu beurteilen, wäre es vorteilhaft, die Auswirkungen der veränderten Muskel Membran Eigenschaften mithilfe einer Spannung-Klemme zu beseitigen. In einer aktuellen Studie wurde die R6/2 neuromuskuläre Übertragung Bedingungen sowohl Strom und Spannung-Klemme mit der beschriebenen Technik hierin untersucht. Die Gesamtheit der motorischen endplatten wurden Spannung eingespannten mit weniger als 1 % Fehler, indem man zwei Mikroelektroden in die Konstante Länge der Endplatte16. Es zeigte sich, dass Spannung-Klemme und Strom-Clamp Aufzeichnungen ergab kontrastierende Messungen der neuromuskulären Übertragung in R6/2 Muskel korrigiert. Dies macht deutlich, dass es schwierig sein kann, EPPs Nichtlinearitäten zu korrigieren, wenn der Muskel-Membran-Eigenschaften geändert wurden und zeigt die Vorteile der Voltage-Clamp-Datensätze, die unabhängig von der Muskel-Membran-Eigenschaften sind zu erhalten. Das Protokoll enthaltenen eignet sich für die Prüfung von Bedingungen oder Krankheitszustände, die synaptische Übertragung und der postsynaptischen Membran Eigenschaften beeinflussen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrieben ist die Vorbereitung und Verwendung der Maus LAL Muskel für die Messung der neuromuskulären Übertragung unter Strom oder Spannung Klemme Bedingungen. Es gibt mehrere wichtige Punkte zu beachten für Sezieren, die LAL. Reinigung überschüssiges Bindegewebe an der Muskel-Aids in Elektrode Impalement, als die Elektroden kann das Bindegewebe Haken, wenn sie für Impalement Positionierung. Jedoch nur entfernen, Bindegewebe, das weggenommen werden kann ganz einfach, die Wahrscheinlichkeit, dass des Muskels…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Mark M. Rich und Daniel Miranda für redaktionelle Kommentare, Ahmad Khedraki für die Unterstützung dieser Technik und Wright State University für die finanzielle Unterstützung (Gründerfonds, A.A.V.) zu etablieren.
Materials
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Axoclamp 900A Amplifier | Molecular Devices | 2500‐0179 | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher | |
Referências
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