Levator Auris Longus Gerilim kelepçe koşullar altında memeli nöromuskuler iletim Sınavı Hazırlık
Summary
Bu raporda açıklanan protokol nöromüsküler kavşak spontan kaydetmek için fare levator auris longus (LAL) kas ve postsinaptik potansiyeller (akım tipi kelepçe) sinir uyarılmış ve akımlar (gerilim tipi kelepçe) kullanır. Bu tekniğin kullanımı hastalık ve normal koşullar altında sinaptik aktarım mekanizmaları içine anahtar anlayışlar verebilir.
Abstract
Bu iletişim kuralı geçerli-kelepçe ve gerilim-kelepçe koşullar altında nöromüsküler kavşak üzerinden kayıt sinaptik iletimi için bir teknik anlatılmaktadır. Çünkü bu motor endplate, elektrot kazığa oturtma için nöromüsküler kavşak kolay görselleştirme sağlar bir ince kas levator auris longus (LAL) ex vivo hazırlanması kullanılır. Bu yöntem için kayıt spontan minyatür endplate potansiyelleri ve akımlar (mEPPs ve mEPCs), endplate sinir uyarılmış potansiyeller ve akımlar (EPPs ve EPCs), aynı zamanda motor endplate membran özelliklerini tanır. Bu yöntem elde edilen sonuçları quantal (QC), vezikül yayın siteleri (n) sayısı, vezikül yayın (prel), sinaptik kolaylaştırma ve depresyon yanı sıra kas zarı zaman sabiti (τ olasılığı içerik m) ve giriş direnci. Bu tekniğin uygulamaya fare modelleri insan hastalık hastalığı Birleşik Devletleri anahtar patolojiler vurgulayın ve roman tedavi stratejileri belirlemek. Tam voltaj-tek bir synapse sıkma tarafından bu yöntem bir sinaptik iletimi şu anda mevcut en ayrıntılı analizlerini sağlar.
Introduction
Nöromusküler kavşakta sinaptik iletimi okuyan gergin ve iskelet kas sistemleri arasındaki dinamik ilişki içine anlayışlar sağlar ve sinaptik Fizyoloji incelenmesi için mükemmel bir model. Levator auris longus (LAL) kolayca görüntülenmeyecektir nöromüsküler kavşak için izin veren bir ince kas var. Önceki raporlar sinaptik uyuşturucu ve toksinler incelemek ve iskelet kas fiber türü özellikleri LAL1,2nitelendirmiştir LAL kullanma kolaylığı anlatmıştık. Çok sayıda çalışma LAL nöromüsküler fizyolojisi3,4,5,6,7,8incelemek için kullandık. Elektrofizyoloji için yetenek kolayca LAL nöromüsküler kavşak gözlemlemek için microelectrodes motor endplate, doğru yerleşimini sağlar ve sinaptik iletimi kayıt alanı kelepçe sorunları büyük ölçüde azaltır. Membran zaman sabiti (τm) ve (Riçinde) giriş direnci gibi kas membran özelliklerini geçerli-kelepçe kayıtları kolayca elde edilir. Ayrıca, bu özellikleri kas zarı özellikleri sinaptik işleve doğrudan karşılaştırması için izin nöromuskuler iletim kaydetmek için kullanılan aynı kas liflerinden ölçülebilir. Bu veri analizi birçok nöromüsküler hastalıklar ve Birleşik değişmiş faaliyet fiziksel mekanizmalarının içine anahtar anlayışlar verebilir.
Burada açıklanan tekniği önemli bir yönü olmayan linearities akım-kelepçe içinde karşılaşılan tabi değildir ve kas membran özelliklerini bağımsız sinaptik kayıtları için gerilim tipi kelepçe kullanımıdır. Nöromuskuler iletim incelemek için gerilim-kelepçe akım tipi kelepçe karşı kullanmanın yararları 1950’lerde9çabalarında öncü tarafından kuruldu. Geçerli-kelepçe altında 10-15 mV genlik içinde aşan EPPs mEPP genlik9doğrusal bir ürün değildir. Örneğin, ortalama mEPP 1 mV, bir EPP 5 mV 5 mEPPs 5 (QC); ürün olarak kabul Oysa, bir EPP 40 mV 40’tan fazla mEPPs ürün olacak. Membran potansiyeli ve asetilkolin reseptörü denge potansiyeli arasındaki farktır EPP için sürüş zorlamak için daha büyük EPPs, bu non-lineer oluşur (~ -10 mV), büyük EPPs sırasında önemli ölçüde azaltır. Çünkü kas membran potansiyeli gerilim tipi kelepçe deneyler sırasında değişmiyor bu sorun gerilim tipi kelepçe deneylerde önlenmiş olur. Bir dezavantajı gerilim tipi kelepçe deneyler daha geçerli-kelepçe kayıt tamamlamak teknik olarak daha zor olmasıdır. Bunu aklýnýzda tutarak, Sigara linearities akım tipi kelepçe kayıtları EPPs10hesapları basit bir matematiksel düzeltme McLachlan ve Martin geliştirdi. Düzeltmeleri de11,12,13iş ama önemlisi, kas zarı özellikleri değil kesintiye varsayıyorum.
Kas zarı özellikleri koşulları ya da kas bozabilir hastalık durumlarında eğitim düşünün özellikle önemlidir. Örneğin, Huntington hastalığı R6/2 transgenik modelinden kas iskelet dinlenme klorür ve potasyum akımları14,15hyperexcitable bir progresif azalma nedeniyle olur. Sonuç olarak mEPPs ve EPPs R6/2 iskelet kas güçlendirilmiş. Kesinlikle, Ek etkenler mEPPs ve EPPs değiştirebilir. SNARE-proteinler8‘ e ilgili gibi görünüyordu EPPs değişiklikleri bulunan farklı bir model Huntington hastalığı fare (R6/1) ile çalışma. Neden değiştirilmiş nöromuskuler iletim mekanizmaları değerlendirmek için gerilim tipi kelepçe kullanarak değiştirilmiş kas zarı özellikleri etkilerini ortadan kaldırmak faydalı olacaktır. Bir son çalışmada, R6/2 nöromuskuler iletim burada açıklanan tekniği kullanarak her iki akım ve gerilim kelepçe koşullar altında incelenmiştir. Motor endplates tamamını gerilim-% 1 hata klempe ile daha az iki microelectrodes endplate16uzunluğu sabit içinde yerleştirerek. Bu gerilim tipi kelepçe gösterildi ve R6/2 kas nöromuskuler iletim zıt ölçümleri vermiştir akım tipi kelepçe kayıtları düzeltti. Bu kas zarı özellikleri üzerinde değişiklik yapılmış Eğer EPPs sigara linearities düzeltmek zor olabileceğini vurgular ve kas membran özelliklerini bağımsız voltaj-kelepçe kayıtlarını edinme yararları göstermektedir. Burada sunulan Protokolü koşulları veya sinaptik iletimi ve postsinaptik membran özelliklerini etkileyen hastalık durumlarında incelenmesi için idealdir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan hazırlık ve akım veya gerilim kelepçe koşullar altında nöromuskuler iletim ölçümü için fareyi LAL kas kullanımı olduğunu. LAL dissekan için göz önünde bulundurulacak birkaç önemli nokta vardır. Aşırı bağ dokusu kas AIDS olarak elektrot elektrot kazığa oturtma’dan temizlik bağ dokusu onları kazığa oturtma için yerleştirirken pürüzle. Ancak, sadece elinden alınan bağ dokusu kaldırmak kolayca kas zarar verme olasılığını sınırlandırmak için. Çünkü çok has…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz Dr Mark M. zengin ve Daniel Miranda Editöryel Yorum için Ahmad Khedraki mali destek (A.A.V. için başlangıç Fonu) için bu tekniği ve Wright Devlet Üniversitesi kurmak yardım ettiğin için teşekkür ederim.
Materials
| Olympus Compound Microscope | Olympus | BX51WI | |
| 10x Objective | Olympus | UMPLFLN10XW | |
| 40x Objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| Borosilicate Glass | Sutter Instruments | BF150-86-7.5 | |
| CCD Camera | Santa Barbara Instruments Group | ST-7XMEI | |
| Axoclamp 900A Amplifier | Molecular Devices | 2500‐0179 | |
| Mater-9 Pulse Generator | AMPI | ||
| Iso-flex Stimulus Isolator | AMPI | ||
| pCLAMP 10 Data Acquisition and Analysis Software | Molecular Devices | 1-2500-0180 | |
| Concentric Bipolar Electrode | FHC | CBDSH75 | |
| Ball-joint Manipulator | Narishige | ||
| Non-metalic Syringes 34 Gauge | World Precision Instruments | MF34G-5 | |
| Nikon Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | |
| No. 5 Forceps | Fine Science Tools | ||
| Spring Scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | |
| No. 2 Forceps | Roboz | RS-5Q41 | |
| Microdissecting Scissors | Roboz | RS-5912SC | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 2404019862 | |
| Hair Removal Cream | Nair | ||
| Grass SD9 Stimulator | Grass Medical | ||
| Model P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-1000 | |
| Axon Digidata 1550 Low-noise Data Acuisition System | Molecular Devices | ||
| Low Pass Bessell Filter | Warner Instrument Corp. | LPF-8 | |
| Left-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DL | |
| Right-handed Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641/45DR | |
| Single Motion Controler | Siskiyou Corp. | MC100e | |
| Crossed Roller Micromanipulator | Siskiyou Corp. | MX1641R | This was added to the Z-axis of the Left and Right-handed micromanipulators to allow the z axis to be motorized. This custom set-up is cheaper and less bulky than buying a 4-axis motorized micromanipulator. It also allows us to control both micromanipulators with one controller |
| All chemicals were orded from Fisher except, | |||
| BTS | Toronto Research Chemicals | B315190 | |
| CTX | Alomone Labs | C-270 | |
| 4-Di-2-Asp | Molecular Probes | Molecular probes is no longer a company. Now ordered through Fisher | |
Referências
- Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: a convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neurosci Lett. 82 (1), 83-88 (1987).
- Erzen, I., Cvetko, E., Obreza, S., Angaut-Petit, D. Fiber types in the mouse levator auris longus muscle: a convenient preparation to study muscle and nerve plasticity. J Neurosci Res. 59 (5), 692-697 (2000).
- Bertone, N. I., et al. Carbonic anhydrase inhibitor acetazolamide shifts synaptic vesicle recycling to a fast mode at the mouse neuromuscular junction. Synapse. , (2017).
- Garcia-Chacon, L. E., Nguyen, K. T., David, G., Barrett, E. F. Extrusion of Ca2+ from mouse motor terminal mitochondria via a Na+-Ca2+ exchanger increases post-tetanic evoked release. J Physiol. 574 (Pt 3), 663-675 (2006).
- Murray, L. M., et al. Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy. Hum Mol Genet. 17 (7), 949-962 (2008).
- Nadal, L., et al. Presynaptic muscarinic acetylcholine autoreceptors (M1, M2 and M4 subtypes), adenosine receptors (A1 and A2A) and tropomyosin-related kinase B receptor (TrkB) modulate the developmental synapse elimination process at the neuromuscular junction. Mol Brain. 9 (1), 67 (2016).
- Rousse, I., St-Amour, A., Darabid, H., Robitaille, R. Synapse-glia interactions are governed by synaptic and intrinsic glial properties. Neurociência. 167 (3), 621-632 (2010).
- Rozas, J. L., Gomez-Sanchez, L., Tomas-Zapico, C., Lucas, J. J., Fernandez-Chacon, R. Increased neurotransmitter release at the neuromuscular junction in a mouse model of polyglutamine disease. J Neurosci. 31 (3), 1106-1113 (2011).
- Takeuchi, A., Takeuchi, N. Further analysis of relationship between end-plate potential and end-plate current. J Neurophysiol. 23, 397-402 (1960).
- McLachlan, E. M., Martin, A. R. Non linear summation of end plate potentials in the frog and mouse. The Journal of Physiology. 311 (1), 307-324 (1981).
- Obis, T., et al. The novel protein kinase C epsilon isoform modulates acetylcholine release in the rat neuromuscular junction. Mol Brain. 8 (1), 80 (2015).
- Silveira, P. E., et al. Ryanodine and inositol triphosphate receptors modulate facilitation and tetanic depression at the frog neuromuscular junction. Muscle Nerve. 52 (4), 623-630 (2015).
- Wood, S. J., Slater, C. R. Safety factor at the neuromuscular junction. Prog Neurobiol. 64 (4), 393-429 (2001).
- Miranda, D. R., et al. Progressive Cl- channel defects reveal disrupted skeletal muscle maturation in R6/2 Huntington’s mice. J Gen Physiol. 149 (1), 55-74 (2017).
- Waters, C. W., Varuzhanyan, G., Talmadge, R. J., Voss, A. A. Huntington disease skeletal muscle is hyperexcitable owing to chloride and potassium channel dysfunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9160-9165 (2013).
- Khedraki, A., et al. Depressed Synaptic Transmission and Reduced Vesicle Release Sites in Huntington’s Disease Neuromuscular Junctions. Journal of Neuroscience. 37 (34), 8077-8091 (2017).
- Greene, E. C. . The anatomy of the rat. , (1955).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent probes that stain living nerve terminals. J Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Jack, J. J. B., Noble, D., Tsien, R. W. . Electric current flow in excitable cells. , (1983).
- Voss, A. A. Extracellular ATP inhibits chloride channels in mature mammalian skeletal muscle by activating P2Y(1) receptors. Journal of Physiology-London. 587 (23), 5739-5752 (2009).
- Albuquerque, E. X., McIsaac, R. J. Fast and slow mammalian muscles after denervation. Experimental Neurology. 26 (1), 183-202 (1970).
- Santafe, M. M., Urbano, F. J., Lanuza, M. A., Uchitel, O. D. Multiple types of calcium channels mediate transmitter release during functional recovery of botulinum toxin type A-poisoned mouse motor nerve terminals. Neurociência. 95 (1), 227-234 (2000).
- Gaffield, M. A., Betz, W. J. Synaptic vesicle mobility in mouse motor nerve terminals with and without synapsin. J Neurosci. 27 (50), 13691-13700 (2007).
- Zhang, Z. S., Nguyen, K. T., Barrett, E. F., David, G. Vesicular ATPase Inserted into the Plasma Membrane of Motor Terminals by Exocytosis Alkalinizes Cytosolic pH and Facilitates Endocytosis. Neuron. 68 (6), 1097-1108 (2010).
