Brugen af to-dimensionelle semi-denaturering vaskemiddel Agarosen gelelektroforese at bekræfte størrelse heterogenitet af Amyloid eller Amyloid-lignende fibre
Summary
Her bruger vi to-dimensionelle semi-denaturering Agarosen gelelektroforese at bekræfte tilstedeværelsen af amyloid-lignende fibre af heterogene størrelse og udelukke muligheden for, at størrelse heterogenitet skyldes dissociation af amyloid fibre under gel kørende proces.
Abstract
Amyloid eller amyloid-lignende fibre har været forbundet med mange menneskelige sygdomme, og nu bliver opdaget at være vigtig for mange signaling veje. Evnen til at let påvise dannelsen af disse fibre under forskellige forsøgsbetingelser er afgørende for at forstå deres potentielle funktion. Mange metoder har været anvendt til at opdage fibre, men ikke uden ulemper. For eksempel, kræver elektronmikroskopi (EM) eller farvning med Congo rød eller Thioflavin T ofte rensning af fibrene. På den anden side tillader semi-denaturering vaskemiddel Agarosen gelelektroforese (SDD-alder) detektering af SDS-resistente amyloid-lignende fibre i celle ekstrakter uden rensning. Desuden, det giver mulighed for sammenligning af størrelse forskellen af fibre. Vigtigere er, kan det bruges til at identificere specifikke proteiner i fibrene af Western blotting. Det er mindre tidskrævende og mere let tilgængelige for en bredere række labs. SDD-alder resultater viser ofte variable graden af heterogenitet. Det rejser spørgsmålet om en del af heterogenitet resultater fra dissociation af protein kompleks under elektroforese i overværelse af SDS. Derfor har vi ansat en anden dimension af SDD-alder til at bestemme, hvis størrelse heterogenitet set i SDD-alder er virkelig et resultat af fiber heterogenitet i vivo og ikke et resultat af enten nedbrydning eller dissociation af nogle af proteinerne under elektroforese. Denne metode giver mulighed for hurtig, kvalitativ bekræftelse af, at den amyloid eller amyloid-lignende fibre ikke delvis adskilles under SDD-alder-processen.
Introduction
Dannelsen af amyloid fibre på grund af protein misfoldning har længe været kendt at spille en rolle i patologiske tilstande som Alzheimers sygdom, Parkinsons sygdom og Huntingtons sygdom1. Senere, dannelsen af amyloid eller amyloid-lignende fibre har vist sig at være en del af signaling veje hos mennesker, herunder under anti-viral medfødte immunrespons2 og necroptosis3,4, og i lavere organismer som gær5,6. Derfor, evnen til at opdage disse fibre i laboratoriet er vigtigt. I øjeblikket, er der tre måder at opdage amyloid og amyloid-lignende fibre: brugen af farvestoffer, EM og SDD-alder.
Brugen af farvestoffer, som Congo rød eller Thioflavin T, tilbyder fordelen at være hurtig og let kan påvises ved hjælp af enten mikroskopi eller spektroskopi7. Påvisning af mikroskopi, i tilfælde af Congo rød, giver imidlertid ingen specificitet som proteiner består af fibrene, eller størrelsen af fibrene. Ligeledes giver brugen af spektroskopi til at opdage Congo rød eller Thioflavin T binding til proteinkomplekser kun et positivt eller negativt resultat.
EM giver afgørende beviser for tilstedeværelsen af fibre og ligeledes kvantitative oplysninger om fiber længde og diameter8. Denne metode kræver imidlertid meget strenge rensning. Derudover er EM en specialiseret teknik, der bruger dyrt udstyr.
SDD-alder er blevet brugt til at registrere SDS-resistente mega Dalton proteinkomplekser herunder amyloid eller amyloid-lignende fibre. Det giver mange fordele. Først, det kræver ikke rensning af fibre og er let at peform9. For det andet giver det kvalitative oplysninger om størrelsen af de fibre, herunder relative størrelse og mængde af fiber heterogenicity. Endelig fordi Western blotting kan udføres efter elektroforese, er det let at påvise tilstedeværelsen af et protein, der er et antistof, selvom det skal bemærkes, at fordi SDD-alder er semi-denaturering, nogle epitoper kan forblive skjult som komplicerer påvisning af antistof.
For nylig, receptor interagerende protein kinase 1 (RIPK1) og 3 (RIPK3) er blevet rapporteret til form amyloid fibre til at tjene som signalering platforme under necroptosis, en programmeret form af nekrose3. Mens de studerer disse fibre, viste vores lab, at en anden necroptosis-forbundet protein, blandet lineage kinase domæne-lignende (MLKL), også dannet amyloid-lignende fibre4. Men efter undersøgelse med SDD-alder, størrelsen af MLKL fibrene syntes adskiller sig fra den RIPK1 og RIPK3 fibre, der syntes identisk med hinanden (figur 1). Dette var uventet, fordi det er velkendt, at MLKL binder sig til RIPK1/RIPK3 til at danne den necroptosis signalering komplekse kaldet necrosome10.
Der er mindst to forklaringer. Første to helt adskilte amyloid-lignende fibre kan danne under necroptosis, en indeholdende RIPK1/RIPK3 og de andre indeholder MLKL. For det andet er kun én type af amyloid-lignende fibre indeholdende RIPK1/RIPK3/MLKL kan dannes under necroptosis, men sammenslutningen af MLKL med de andre proteiner svage nok, som det tager under SDD-alder.
For at løse dette, foreslår vi udfører et todimensionelt (2D) SDD-alder. SDD-alder-stabil amyloid eller amyloid-lignende fibre vil have den samme migration mønster under første og anden dimension elektroforese. Dette vil kunne påvises efter overførsel af proteiner på en membran og udfører en vestlige skamplet. Stabil fibre vil udstille en skarp diagonal mønster. Enhver afvigelse fra dette tyder på, at fibrene undergå ændringer som følge af SDS-elektroforese.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det mest kritiske aspekt af de 2D SDD-alder er at de elektroforese betingelser er de samme for den første og anden dimension. Evnen til at opdage en skarp diagonal linje på 45° (der angiver, at ingen dissociation eller nedbrydning er opstået) afhænger af fibrene migrere Ansoegningsformularen under begge electrophoreses. Ved hjælp af forskellige betingelser, for eksempel ændre spændingen eller længden på kørselstidspunktet, vil skjule disse resultater. Også, som det er tilfældet for traditionelle 1D SDD-alder…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde støttes af et stipendium for S.H.-A. fra NIH/NCATS (TL1TR001104), en Welch Foundation giver (I-1827) og et R01 tilskud fra NIGMS (RGM120502A) til Z.W. Z.W. er Virginia Murchison Linthicum Scholar i medicinalforskning og forebyggelse af kræft og Research Institute af Texas Scholar (R1222).
Materials
| gel electrophoresis unit | Fisher | HE99XPRO | appratus for gel running. |
| agrose | VWR | 97062-250 | For agarose gel. |
| paper tower | Fisher | 19-120-2484 | for transfering |
| filter paper | VWR | 21427-386 | for transfering |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | for transfering |
| blocking milk powder | Bio-Rad | 1706404XTU | for blocking in Western blot |
| MLKL antibody | Genetex | GTX107538 | rabbit anti-MLKL antibody |
| RIPK1 antibody | BD Biosciences | 610459 | mouse anti-RIPK1 antibody |
| RIPK3 antibody | gift from Dr. Xiaodong Wang | rabbit anti-RIPK3. See refenence 11. | |
| anti-Rabbit-HRP | Sigma | A6154 | secondary antibody |
| ECL | Fisher | WBKLS0500 | Western chemiluminescent HRP substrate |
| X-ray film | Fisher | F-BX810 | for Western blot result |
| DMEM | Sigma | D6429 | for cell culture |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | for cell culture |
| penicilin-streptomycin | Sigma | P4333 | for cell culture |
| Trypsin solution | Sigma | T4049 | for cell culture |
| PBS for tissue culture | Sigma | D8662 | for cell culture |
| recombinant TNF | made in our lab | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| smac-mimetic | gift from Dr. Xiaodong Wang | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| ZVAD-FMK | ApexBio | A1902 | for inducing necroptosis. See reference 11. |
| Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Model TC20; for counting cells |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | for measuring protein concentration in cell lysates |
| Cell lifter | Fisher | 07-200-364 | to remove cells from dish |
| Lysis Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired) |
||
| 10X TAE (1 L) | 48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L |
||
| 4X SDD-AGE loading buffer (50 mL) | 5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O |
||
| TBS Transfer Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O |
||
| PBST Wash Buffer (1 L) | 100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20 |
||
| 10X PBS (10 L) | 800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L |
Referências
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature medicine. 10, 10-17 (2004).
- Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
- Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
- Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).
- Uptain, S. M., Lindquist, S. Prions as protein-based genetic elements. Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).
- Halfmann, R., Lindquist, S. Screening for amyloid aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis. J Vis Exp. , (2008).
- Sipe, J. D., et al. Nomenclature 2014: Amyloid fibril proteins and clinical classification of the amyloidosis. Amyloid : the international journal of experimental and clinical investigation : the official journal of the International Society of Amyloidosis. 21, 221-224 (2014).
- Eisenberg, D. S., Sawaya, M. R. Structural Studies of Amyloid Proteins at the Molecular Level. Annual review of biochemistry. 86, 69-95 (2017).
- Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. . Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148, 213-227 (2012).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137, 1100-1111 (2009).
