दो आयामी अर्द्ध denaturing डिटर्जेंट Agarose जेल ट्रो का उपयोग Amyloid या Amyloid फाइबर की तरह आकार विविधता की पुष्टि करने के लिए
Summary
यहां हम दो आयामी अर्द्ध denaturing agarose जेल ट्रो का उपयोग करने के लिए विषम आकार के amyloid की तरह फाइबर की उपस्थिति की पुष्टि और संभावना है कि आकार विविधता जेल के दौरान पृथक्करण फाइबर के amyloid के कारण है बाहर प्रक्रिया चल रही है ।
Abstract
Amyloid या Amyloid की तरह फाइबर कई मानव रोगों के साथ जुड़ा हुआ है, और अब कई संकेत रास्ते के लिए महत्वपूर्ण होने की खोज की जा रही है । आसानी से विभिंन प्रायोगिक शर्तों के तहत इन तंतुओं के गठन का पता लगाने की क्षमता उनके संभावित समारोह को समझने के लिए आवश्यक है । फाइबर का पता लगाने के लिए कई तरीकों का इस्तेमाल किया गया है, लेकिन बिना कुछ कमियां के नहीं । उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (EM), या कांगो लाल या Thioflavin टी के साथ धुंधला अक्सर फाइबर की शुद्धि की आवश्यकता है । दूसरी ओर, अर्द्ध denaturing डिटर्जेंट agarose जेल ट्रो (SDD-आयु) शुद्धि के बिना कोशिका निष्कर्षों में एसडीएस-प्रतिरोधी amyloid फाइबर का पता लगाने की अनुमति देता है । इसके अलावा, यह फाइबर के आकार के अंतर की तुलना की अनुमति देता है । इससे भी महत्वपूर्ण बात, यह पश्चिमी सोख्ता द्वारा तंतुओं के भीतर विशिष्ट प्रोटीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह कम समय लगता है और प्रयोगशालाओं की एक व्यापक संख्या के लिए और अधिक आसानी से सुलभ है । SDD-आयु परिणाम अक्सर विविधता के चर डिग्री दिखाओ । यह सवाल उठाता है कि एसडीएस की मौजूदगी में ट्रो के दौरान प्रोटीन कॉम्प्लेक्स के पृथक्करण से विविधता परिणामों का हिस्सा है या नहीं. इस कारण से, हम SDD-आयु का एक दूसरा आयाम नियोजित किया है निर्धारित करने के लिए अगर आकार SDD में देखा विविधता-आयु सही मायने में vivo में फाइबर विविधता का एक परिणाम है और या तो गिरावट या कुछ के दौरान प्रोटीन के पृथक्करण का परिणाम नहीं वैद्युतकणसंचलन. इस विधि की अनुमति देता है तेज, गुणात्मक पुष्टि कि amyloid या amyloid फाइबर SDD-आयु प्रक्रिया के दौरान आंशिक रूप से dissociating नहीं हैं ।
Introduction
प्रोटीन के कारण amyloid तंतुओं का गठन लंबे समय तक इस तरह के अल्जाइमर रोग, पार्किंसंस रोग, और Huntington की बीमारी के रूप में रोग की स्थिति में एक भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है1। हाल ही में, amyloid या amyloid-फाइबर की तरह गठन विरोधी वायरल जंमजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया2 और necroptosis3,4, और कम जीवों में सहित मनुष्यों में रास्ते संकेत का एक हिस्सा हो दिखाया गया है जैसे खमीर5,6। इसलिए लैब में इन फाइबर का पता लगाने की क्षमता जरूरी है । वर्तमान में, वहां तीन मुख्य amyloid और amyloid की तरह फाइबर का पता लगाने के तरीके हैं: रंजक, EM, और SDD-उंर का उपयोग करें ।
ऐसे कांगो लाल या Thioflavin टी के रूप में रंजक का उपयोग करते हैं, तेजी से होने का लाभ प्रदान करता है और आसानी से या तो माइक्रोस्कोपी या स्पेक्ट्रोस्कोपी7का उपयोग कर पता लगाने. हालांकि, माइक्रोस्कोपी द्वारा पता लगाने, कांगो लाल के मामले में, जो प्रोटीन फाइबर, या फाइबर का आकार शामिल के बारे में कोई विशिष्टता प्रदान करता है । इसी तरह, स्पेक्ट्रोस्कोपी के उपयोग के लिए कांगो लाल या Thioflavin टी बाध्यकारी प्रोटीन कॉंप्लेक्स का पता लगाने के लिए केवल एक सकारात्मक या नकारात्मक परिणाम प्रदान करता है ।
उंहें फाइबर की उपस्थिति के निर्णायक सबूत प्रदान करता है और यह भी तंतु की लंबाई और व्यास के बारे में मात्रात्मक जानकारी8। हालांकि, इस विधि में बहुत कड़े शुद्धिकरण की आवश्यकता है । इसके अतिरिक्त, EM एक विशेष तकनीक है जो महंगे उपकरणों का उपयोग करता है ।
SDD-आयु amyloid या amyloid जैसे तंतुओं सहित एसडीएस प्रतिरोधी मेगा डाल्टन प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है । यह कई फायदे प्रदान करता है । सबसे पहले, यह फाइबर की शुद्धि की आवश्यकता नहीं है और peform करने के लिए आसान है9. दूसरा, यह फाइबर heterogenicity के सापेक्ष आकार और मात्रा सहित तंतुओं के आकार के बारे में गुणात्मक जानकारी प्रदान करता है । अंत में, क्योंकि पश्चिमी सोख्ता ट्रो के बाद प्रदर्शन किया जा सकता है, यह किसी भी प्रोटीन है जिसके लिए वहां एक एंटीबॉडी है की उपस्थिति का पता लगाने के लिए आसान है, हालांकि यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि क्योंकि SDD-आयु अर्द्ध denaturing है, कुछ epitopes छुपा रह सकता है जो एंटीबॉडी द्वारा पता लगाने पेचीदा है ।
हाल ही में, रिसेप्टर बातचीत प्रोटीन कळेनासे 1 (RIPK1) और 3 (RIPK3) necroptosis, परिगलन के एक क्रमादेशित फार्म के दौरान प्लेटफार्मों सिग्नलिंग के रूप में सेवा करने के लिए amyloid फाइबर फार्म करने के लिए सूचित किया गया है3. इन तंतुओं का अध्ययन करते हुए, हमारी प्रयोगशाला से पता चला कि एक और necroptosis-जुड़े प्रोटीन, मिश्रित वंश कळेनासे डोमेन की तरह (MLKL), भी गठन amyloid की तरह फाइबर4. हालांकि, SDD-उंर के साथ परीक्षा पर, MLKL फाइबर के आकार RIPK1 और RIPK3 फाइबर, जो एक दूसरे के समान दिखाई (चित्रा 1) से अलग दिखाई दिया. यह अप्रत्याशित था क्योंकि यह अच्छी तरह से जाना जाता है कि MLKL बांध RIPK1/RIPK3 को necroptosis संकेतन परिसर के रूप में necrosome10बुलाया ।
इसमें कम से दो स्पष्टीकरण हैं । सबसे पहले, दो पूरी तरह से अलग amyloid फाइबर necroptosis के दौरान फार्म का हो सकता है, एक युक्त RIPK1/RIPK3 और अंय MLKL युक्त । दूसरा, केवल एक प्रकार की amyloid फाइबर युक्त RIPK1/RIPK3/MLKL के दौरान necroptosis का गठन किया जा सकता है, लेकिन अंय प्रोटीन के साथ MLKL के संघ काफी कमजोर है कि यह dissociates के दौरान SDD-उंर ।
यह पता करने के लिए, हम एक दो आयामी (2d) SDD उंर प्रदर्शन का प्रस्ताव । SDD-आयु-स्थिर amyloid या amyloid-जैसे तंतुओं का पहला और दूसरा आयाम ट्रो के दौरान ही माइग्रेशन पैटर्न होगा. यह एक झिल्ली को प्रोटीन स्थानांतरित करने और एक पश्चिमी दाग बाहर ले जाने के बाद detectable हो जाएगा । स्थिर फाइबर एक तेज तिरछी पैटर्न का प्रदर्शन करेंगे । इस से कोई विचलन सुझाव है कि तंतुओं एसडीएस-ट्रो के कारण परिवर्तन से गुजरना होगा ।
Protocol
Representative Results
Discussion
2d SDD-आयु का सबसे विचारणीय पहलू यह है कि ट्रो स्थितियां पहले और दूसरे आयाम के लिए ही हैं । ४५ डिग्री पर एक तेज तिरछी रेखा का पता लगाने की क्षमता (यह दर्शाता है कि कोई पृथक्करण या क्षरण हुआ है) दोनों electrophoreses के द?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम S.H.-ए के लिए एक फैलोशिप द्वारा समर्थित है । से NIH/NCATS (TL1TR001104), एक वेल्च फाउंडेशन अनुदान (I-१८२७), और R01 (NIGMS) से RGM120502A Z.W. से एक Z.W. अनुदान चिकित्सा अनुसंधान और कैंसर की रोकथाम और टेक्सास विद्वान (Murchison) के अनुसंधान संस्थान में वर्जीनिया Linthicum R1222 विद्वान है ।
Materials
| gel electrophoresis unit | Fisher | HE99XPRO | appratus for gel running. |
| agrose | VWR | 97062-250 | For agarose gel. |
| paper tower | Fisher | 19-120-2484 | for transfering |
| filter paper | VWR | 21427-386 | for transfering |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | for transfering |
| blocking milk powder | Bio-Rad | 1706404XTU | for blocking in Western blot |
| MLKL antibody | Genetex | GTX107538 | rabbit anti-MLKL antibody |
| RIPK1 antibody | BD Biosciences | 610459 | mouse anti-RIPK1 antibody |
| RIPK3 antibody | gift from Dr. Xiaodong Wang | rabbit anti-RIPK3. See refenence 11. | |
| anti-Rabbit-HRP | Sigma | A6154 | secondary antibody |
| ECL | Fisher | WBKLS0500 | Western chemiluminescent HRP substrate |
| X-ray film | Fisher | F-BX810 | for Western blot result |
| DMEM | Sigma | D6429 | for cell culture |
| fetal bovine serum | Sigma | F4135 | for cell culture |
| penicilin-streptomycin | Sigma | P4333 | for cell culture |
| Trypsin solution | Sigma | T4049 | for cell culture |
| PBS for tissue culture | Sigma | D8662 | for cell culture |
| recombinant TNF | made in our lab | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| smac-mimetic | gift from Dr. Xiaodong Wang | for inducing necroptosis. See reference 11. | |
| ZVAD-FMK | ApexBio | A1902 | for inducing necroptosis. See reference 11. |
| Cell Counter | Bio-Rad | 1450102 | Model TC20; for counting cells |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | for measuring protein concentration in cell lysates |
| Cell lifter | Fisher | 07-200-364 | to remove cells from dish |
| Lysis Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 10 mL glycerol 30 mL 5 M NaCl 840 mL ddH2O 10 mL Triton-X100 (protease and phosphates inhibitors as desired) |
||
| 10X TAE (1 L) | 48.4 g Tris base 11.42 mL glacial acetic acid 20 mL 0.5M EDTA pH 8 ddH20 to 1 L |
||
| 4X SDD-AGE loading buffer (50 mL) | 5 mL 10X TAE 10 mL glycerol 4 mL 20% SDS 0.5 mL 10% bromophenol blue 31 mL ddH2O |
||
| TBS Transfer Buffer (1 L) | 20 mL 1 M Tris pH 7.4 30 mL 5 M NaCl 950 mL ddH2O |
||
| PBST Wash Buffer (1 L) | 100 mL 10xPBS 800 mL ddH2O 1 mL Tween20 |
||
| 10X PBS (10 L) | 800 g NaCl 20 g KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 add ddH2O to 10 L |
Referências
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- Hou, F., et al. MAVS forms functional prion-like aggregates to activate and propagate antiviral innate immune response. Cell. 146, 448-461 (2011).
- Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150, 339-350 (2012).
- Liu, S., et al. MLKL forms disulfide bond-dependent amyloid-like polymers to induce necroptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 7450-7459 (2017).
- Uptain, S. M., Lindquist, S. Prions as protein-based genetic elements. Annual review of microbiology. 56, 703-741 (2002).
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