Gene målrettede tilfeldig mutagenese Velg Heterochromatin-destabilisere Proteasome mutanter fisjon gjær
Summary
Denne artikkelen beskriver en detaljert metodikk for tilfeldige mutagenese med et mål i fisjon gjær. Som et eksempel målet vi rpt4 +, som koder en undergruppe av 19S proteasome og skjermen for mutasjoner som destabilisere heterochromatin.
Abstract
Tilfeldige mutagenese med et mål brukes vanligvis til å identifisere mutasjoner som gir ønsket fenotypen. Av metoder som kan brukes til å oppnå tilfeldig mutagenese, feilutsatte PCR er en praktisk og effektiv strategi for å generere en variert samling av mutanter (dvs., en mutert biblioteket). Feilutsatte PCR er metoden for valg når forsker søker å mutere et forhåndsdefinert område, som koding regionen et gen samtidig la andre genomisk regioner upåvirket. Etter mutant biblioteket forsterkes av feilutsatte PCR, må det være klonet i en egnet plasmider. Størrelsen på biblioteket generert av feilutsatte PCR er begrenset av effektiviteten av kloning trinnet. Men i fisjon gjær, Schizosaccharomyces pombe, kan kloning trinnet erstattes ved bruk av en svært effektiv ettrinns fusjon PCR generere konstruksjoner for transformasjon. Mutanter av ønsket fenotyper kan deretter velges med passende journalister. Her beskriver vi denne strategien i detalj, ta for eksempel, en reporter satt inn på centromeric heterochromatin.
Introduction
Fremover genetikk er en klassisk metode som forskere søker naturlig forekommende mutanter som viser en bestemt fenotype, og utføre genetiske analyser. I omvendt genetikk, mutasjoner innføres i en genet av interesse og fenotypen undersøkes. I det siste tilfellet brukes ofte tilfeldige mutagenese med et mål å generere en pool av mutanter som velges senere for ønsket fenotyper, som temperatur følsomhet eller endret enzymatisk aktivitet. Ulike metoder kan brukes til å oppnå tilfeldig mutagenese, inkludert feilutsatte PCR1; UV bestråling2; kjemisk mutagener, som ethyl methanesulfonate (EMS) eller nitrøse syre3; Bruk av midlertidige mutator stammer, som de over uttrykke mutD5 4; og DNA stokking5.
Her beskriver vi en omvendt-genetikk strategi som vi utnytter feilutsatte PCR vil generere mutant basseng for et mål gen i fisjon gjær. Som en kunne gjette fra navnet, genererer denne metoden mutasjoner av bevisst introdusere feil under PCR. I motsetning til andre mutagenese metoder tillater feilutsatte PCR brukeren å definere regionen for å være mutagenized. Dette gjør det spesielt nyttig i arbeidet med å studere funksjonen av et protein/domene av interesse.
For å demonstrere dette tilfeldig mutagenese prosedyre, bruk vi her rpt4 +, som koder 19S proteasome delenhet, som et eksempel. Rpt4 har vist seg å ha uavhengig av proteolyse funksjoner i organismer enn fisjon, gjær,6,,7,,8,,9, og en feil i proteolyse føre indirekte effekter ved å endre proteiner nivåer. Vi er derfor vist for mutanter som utløste proteolyse-uavhengig endringer, med mål om å undersøke funksjonen til proteasome på heterochromatin.
Feilutsatte PCR kan brukes til alle gen-regionen ved å justere plasseringen der primerne binde. Mutanter som viser ønsket fenotypiske endringen kan identifiseres med riktig journalister. Her vi utnyttet en ade6 + reporter satt på centromere 1 ytre gjenta (otr) regionen10. Grunnleggende heterochromatin blir dannet denne regionen11, så ade6 + reporteren er stille i vill-type tilstand; Dette indikeres av røde kolonier10. En mutasjon som destabilizes den grunnleggende heterochromatin på centromere vil føre til uttrykk for ade6 + reporteren, som er visualisert som hvit kolonier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tilfeldige mutagenese via feilutsatte PCR er et kraftig verktøy for å generere en variert samling av mutanter i en gitt region. Denne teknikken er spesielt nyttig for studier som søker å vurdere funksjon av et protein under et bestemt forhold. For eksempel brukt vi her feilutsatte PCR for å vurdere funksjon 19S proteasome underenheten, Rpt4, i heterochromatin vedlikehold. Ved å variere regionen målrettet av feilutsatte PCR og justering av screening forholdene, kunne vi mutere cellene på genomisk regionen interess…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Midler støtte til dette prosjektet ble gitt av grunnleggende vitenskap forskningsprogrammet gjennom National Research Foundation av Korea (NRF) finansiert av departementet for vitenskap og IKT (2016R1A2B2006354).
Materials
| 1. Media | |||
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212720 | |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | |
| Adenine sulfate | ACR | 16363-0250 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8125 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | JUNSEI | 19015-0350 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Potassium phthalate | Sigma-Aldrich | P6758-500g | |
| Inositol | Sigma-Aldrich | I7508-50G | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | Sigma-Aldrich | M7634-500G | |
| ZnSO4•7H2O | JUNSEI | 83060-031 | |
| FeCl2•4H2O | KANTO | CB8943686 | |
| Sodium molybdate dihydrate | YAKURI | 31621 | |
| KI | JUNSEI | 80090-0301 | |
| CuSO4•5H2O | YAKURI | 09605 | |
| D-myo-inositol | MP biomedicals | 102052 | |
| Pantothenate | YAKURI | 26003 | |
| Nicotinic Acid | Sigma-Aldrich | N4126-500G | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Agarose | Biobasic | D0012 | |
| G418, geneticin | LPS | G41805 | |
| 2. Enzyme reactions | |||
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aglient | 600380 | For site-directed mutagenesis |
| GeneMorphII Random mutagenesis Kit | Aglient | 200500 | For error-prone PCR |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F-530L | For fusion PCR |
| Ex Taq DNA Polymerase | Takara | RR001b | For general PCR |
| BamH1 | New England BioLabs | R0136S | |
| Xho1 | New England BioLabs | R0146S | |
| Dpn1 | New England BioLabs | R0176S | |
| 3. Equipment | |||
| Velveteen square, black | VWR | 89033-116 | For replica |
| Replica-plating tool | VWR | 25395-380 | For replica |
| MicroPulser Electroporator | Biorad | 1652100 | For fission yeast transformation |
| Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap | Biorad | 1652086 | For fission yeast transformation |
| Thermal Cycler | Bioer | BYQ6078 | For fusion PCR ramp reaction |
Referências
- Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. A general model of error-prone PCR. J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 194, 795-823 (1991).
- Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl Environ Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
- Cohen, J. How DNA shuffling works. Science. 293 (5528), 237 (2001).
- Sahu, P. P., Sharma, N., Puranik, S., Chakraborty, S., Prasad, M. Tomato 26S Proteasome subunit RPT4a regulates ToLCNDV transcription and activates hypersensitive response in tomato. Sci Rep. 6, 27078 (2016).
- Xu, Q., Singer, R. A., Johnston, G. C. Sug1 modulates yeast transcription activation by Cdc68. Mol Cell Biol. 15 (11), 6025-6035 (1995).
- Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Mol Immunol. 45 (8), 2214-2224 (2008).
- Chang, C., et al. The Gal4 activation domain binds Sug2 protein, a proteasome component, in vivo and in vitro. J Biol Chem. 276 (33), 30956-30963 (2001).
- Ekwall, K., Cranston, G., Allshire, R. C. Fission yeast mutants that alleviate transcriptional silencing in centromeric flanking repeats and disrupt chromosome segregation. Genética. 153 (3), 1153-1169 (1999).
- Grewal, S. I., Jia, S. Heterochromatin revisited. Nat Rev Genet. 8 (1), 35-46 (2007).
- Forsburg, S. L. . Forsburg Lab Recipes: Fission Yeast Media. , (2011).
- . . QIAquick PCR Purification Kit. , (2013).
- . . pBlueScript II Vector. , (2005).
- . . QIAquick Gel Extraction Kit. , (2013).
- . . QuickGene SP Kit Plasmid Kit II (SP-PL2). , (2016).
- . . PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase. , (2004).
- . . Gibson Assembly Master Mix. , (2017).
- . . GeneMorph II Random Mutagenesis Kits. , (2012).
- . . Plasmid Plus Midi Kit. , (1999).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Szewczyk, E., et al. Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans. Nat Protoc. 1 (6), 3111-3120 (2006).
- Nurse, P. . Fission Yeast Handbook. , (2000).
- Seo, H. D., et al. The 19S proteasome is directly involved in the regulation of heterochromatin spreading in fission yeast. J Biol Chem. , (2017).
- Tang, N. H., et al. Generation and characterisation of temperature sensitive mutants of genes encoding the fission yeast spindle pole body. PeerJ Preprints. 5, e3377v3371 (2017).
- Rasooly, A., Weisz, A. In vitro antibacterial activities of phloxine B and other halogenated fluoresceins against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 46 (11), 3650-3653 (2002).
- Wilson, D. S., Keefe, A. D. Random mutagenesis by PCR. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
