وثمة نهج بديل لدراسة الأحداث الرئيسية في نيوروديجينيريشن باستخدام شرائح المخ الفئران السابقين فيفو
Summary
نقدم أسلوب الذي يمكن تقديم المزيد من الأفكار في أحداث أوائل الكامنة وراء نيوروديجينيريشن واستنادا إلى تقنية الدماغ المنشأة السابقين فيفو ، الجمع بين مزايا تجارب في الجسم الحي وفي المختبر . وعلاوة على ذلك، فإنه يمثل فرصة فريدة لإجراء مقارنة مباشرة لفريق المعالجة وغير المعالجة في نفس الطائرة التشريحية.
Abstract
وعلى الرغم من العديد من الدراسات التي تسعى إلى تطوير نماذج حيوانية الموثوقة التي تعكس الأولية العمليات الأساسية نيوروديجينيريشن، عدد قليل جداً وقد قبلت على نطاق واسع. هنا، فإننا نقترح إجراء جديد مقتبس من المعروفين السابقين فيفو الدماغ شريحة تقنية، مما يوفر أوثق في فيفو–مثل السيناريو مما في المختبر الأعمال التحضيرية، للتحقيق في أحداث أوائل تسبب ضمور الخلية، كما ويلاحظ في مرض الزهايمر (AD). يتكون هذا الاختلاف من خطوات بسيطة واستنساخه بسهولة، التي تمكن من الحفاظ على سيتوارتشيتيكتوري التشريحية لمنطقة الدماغ المحددة والوظائف المحلية في بيئة فسيولوجية. يمكن الحصول على مختلف المناطق التشريحية من الدماغ نفسه، وإتاحة الفرصة للقيام بتجارب متعددة مع العلاجات المذكورة في الموقع-والجرعة-، وطريقة تعتمد على الوقت. القيود المحتملة التي يمكن أن تؤثر على النتائج ذات الصلة بهذه المنهجية المرتبطة بالمحافظة على النسيج، أي الحفاظ على سلامتها التشريحية خلال خطوات تشريح والحضانة وسمك الفرع، الذي يمكن أن تؤثر تحليل البيوكيميائية والمناعي. ويمكن استخدام هذا النهج لأغراض مختلفة، مثل استكشاف الآليات الجزيئية التي تشارك في الظروف الفسيولوجية أو المرضية، وفحص المخدرات، أو فحوصات الجرعة والاستجابة. وأخيراً، هذا البروتوكول يمكن أيضا خفض عدد الحيوانات المستخدمة في الدراسات السلوكية. تم مؤخرا ووصف التطبيق ذكرت هنا واختبارها لأول مرة على السابقين فيفو الفئران الدماغ الشرائح التي تحتوي على فوريبرين القاعدية (BF)، التي واحدة من المناطق الدماغية التي تؤثر أساسا في الإعلان. على وجه التحديد، وقد ثبت أن إدارة الببتيد السمية المستمدة من ج-محطة أستيلكولينستراز (وجع) يمكن أن يدفع الشخصية مثل الإعلان، تحريك، طول المحور الخلفي أنتيرو لفرنك بلجيكي، تعبير تفاضلي من البروتينات التي غيرت في الإعلان، مثل مستقبلات النيكوتين alpha7 (α7-ناشر)، فوسفوريلاتيد تاو (فتاو)، وبيتا اميلويد (Aβ).
Introduction
الإعلان علم أمراض مزمنة التي تتسم بضعف تدريجي الأعصاب التي تؤثر على مناطق الدماغ المختلفة، مثل قشرة انتورهينال (المفوضية الأوروبية)، فرنك بلجيكي، والحصين (المفوض السامي) ولمبة شمي (OB)1،2،3، 4،5. المراحل المتأخرة من تطوير الإعلان يؤدي إلى انخفاض المعرفي تدريجي، مما يجعل هذا المرض الأكثر شيوعاً للعته، تستأثر بحوالي 70 في المائة من جميع الحالات6. وعلى الرغم من محاولات واسعة النطاق لفهم المراحل الأولية مما تسبب في الإعلان، لا توجد حاليا إشارة تجريبية محددة بتوضيح لهم. وباﻹضافة إلى ذلك، النظرية الأكثر شعبية–“فرضية اميلويد”-شك متزايد نظراً لأنها لا تقدم صورة كاملة في شرح بل الإعلانية، ولا هدفا صيدلانية التي أثبتت فعالية7،8 ،9.
يوحي نظرية بديلة التي تحظى باهتمام متزايد بأن الآليات الأولية التي تحدث أثناء نيوروديجينيريشن ترتبط بكتلة الخلايا العصبية عرضه أساسا في الإعلان3،،من1011 , 12 , 13 , 14-هذا المحور الخلوية غير المتجانسة ضمن المشاريع فرنك بلجيكي، midbrain والدماغ، إلى مناطق متعددة، مثل المفوضية الأوروبية والمفوض السامي، والحريق المكشوف15،16. على الرغم من تنوعها في مورفولوجيا الخلايا العصبية وتوليف العصبي، تشاطر جوهر هذه الخلايا سمة مشتركة في الإعراب عن وجع، الذي يمكن أن يكون أيضا وظيفة غير الانزيمية17،18. هذا الدور غير الكلاسيكية كرواية إشارات جزيء يتوسط تدفق الكالسيوم (Ca2 +) إلى الخلايا العصبية التي يمكن أن تخضع لإحداث التغذوية أو السمية بالنسبة Ca2 + الجرعة وتوافرها والعصبية سن17،18 , 19.
أثناء نيوروديجينيريشن، لوحظت الخلوية قد تكون الخسارة ولذلك المنتسبة إلى هذه الدالة غير الانزيمية17،،من1820، الذي يعزى إلى ببتيد 30mer (T30) المشقوق من ألم ج-المحطة 20-تمشيا مع النتائج السابقة، التي تقوم على ثقافة الخلية والتصوير الضوئي21 18،الاستعدادات، أظهرنا، من خلال اتباع نهج جديد يستند إلى السابقين فيفو الفئران الدماغ الشرائح التي تحتوي على هياكل فرنك بلجيكي، T30 الناجمين عن الشخصية مثل الإعلان22. على وجه التحديد، وهذه المنهجية الجديدة يقدم سيناريو فسيولوجية أكثر من خلية ثقافة حيث أنها تحتفظ بالكثير من الخصائص أنسجة سليمة، بدءاً من التشريحية للحفاظ على الدوائر، أن كان لإطار زمني لساعات. قمنا بتطبيق هذا البروتوكول على استكشاف الأحداث التي تجري خلال المراحل الأولى من نيوروديجينيريشن، رصد الاستجابة الحادة عند تطبيق T30.
على الرغم من الكم الكبير من المؤلفات المتعلقة بالمخ باستخدام شرائح للتحقيق في المسارات الجزيئية ضمناً في تلف الخلايا العصبية أو الخلايا،من2324، هذا البروتوكول يوفر للمرة الأولى أكثر إلحاحا ومقارنة حساسة تلا باستخدام شرائح أورجانوتيبيك المشتركة. ومع ذلك، كما الحال بالنسبة أورجانوتيبيك أقسام الدماغ، هذا الإجراء شريحة الحاد يمكن أيضا اعتماد لأغراض عدة، مثل تقييم محصن أو جزيئات سمية عصبية، اكتشاف التغيرات الجزيئية الأساسية التي تحدث في عملية محددة، الأمراض المتصلة بالتحليل المناعي، وفحوصات الدوائية للجهاز العصبي المركزي.
Protocol
Representative Results
Discussion
الجانب الرئيسي من هذا البروتوكول، استناداً إلى تقنية الدماغ راسخة السابقين فيفو ، يسمح بشكل متزامن اختبار اثنين هيميسليسيس براق، التي تم الحصول عليها من نفس الطائرة التشريحية، رصد استجابتها بعد تطبيق محدد الشرط (السيطرة أو معاملة)؛ ولهذا يقدم نموذج تجريبي لرقابة مشددة قدر الإمكان. ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل بالعصبية الحيوية المحدودة. نود أن نشكر الدكتور سيرجيو Rotondo (العصبية-الحيوية) والدكتور جيوفاني فراتي للتعليقات والمشورة بشأن المخطوطة.
Materials
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germany | S7653 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich, Germany | P9333 | Reagent for aCSF preparation |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germany | S5761 | Reagent for aCSF preparation |
| Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germany | 63138 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germany | P5655 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes salt | Sigma-Aldrich, Germany | H7006 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes acid | Sigma-Aldrich, Germany | H3375 | Reagent for aCSF preparation |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Germany | G7528 | Reagent for aCSF preparation |
| Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich, Germany | 223506 | Reagent for aCSF preparation |
| T30 peptide | Genosphere Biotechnologies, France | AChE-derived peptide tested | |
| Surgical dissecting kit | World Precision Instruments, USA | Item #: MOUSEKIT | Brain removal step |
| Surgical blades | Swann-Morton, UK | BS 2982 | Brain removal step |
| Filter paper | Fisher Scientific, USA | 11566873 | Brain preparation for slicing |
| Glue | Brain preparation for slicing | ||
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000 S | Slicing |
| Brushes | Tissue handling | ||
| Oxygen canister | Sectioning and incubation phase | ||
| 1x Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | Homogenization step |
| Phosphatase inhibitors | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | Homogenization step |
| Protease inhibitors | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | Homogenization step |
| Pestles | Starlab, UK | I1415-5390 | Homogenization step |
| Microcentrifuge | |||
| Pierce 660 nm Protein Assay | Thermo Scientific, USA | 22660 | Protein concentration |
Referências
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathologica. 82 (4), 239-259 (1991).
- Schliebs, R. Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer’s disease–interrelationship with beta-amyloid, inflammation and neurotrophin signaling. Neurochemical Research. 30 (6-7), 895-908 (2005).
- Schmitz, T. W., et al. Basal forebrain degeneration precedes and predicts the cortical spread of Alzheimer’s pathology. Nature Communications. 7, 13249 (2016).
- Fjell, A. M., McEvoy, L., Holland, D., Dale, A. M., Walhovd, K. B. What is normal in normal aging? Effects of aging, amyloid and Alzheimer’s disease on the cerebral cortex and the hippocampus. Progress in neurobiology. 117, 20-40 (2014).
- Kovács, T., Cairns, N. J., Lantos, P. L. Olfactory centres in Alzheimer’s disease: olfactory bulb is involved in early Braak’s stages. Neuroreport. 12 (2), 285-288 (2001).
- Winblad, B., et al. Defeating Alzheimer’s disease and other dementias: a priority for European science and society. The Lancet Neurology. 15 (5), 455-532 (2016).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- De Strooper, B., Karran, E. The Cellular Phase of Alzheimer’s Disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer’s disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Arendt, T., Brückner, M. K., Lange, M., Bigl, V. Changes in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer’s disease resemble embryonic development-A study of molecular forms. Neurochemistry International. 21 (3), 381-396 (1992).
- Auld, D. S., Kornecook, T. J., Bastianetto, S., Quirion, R. Alzheimer’s disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies. Progress in Neurobiology. 68 (3), 209-245 (2002).
- Arendt, T., Bruckner, M. K., Morawski, M., Jager, C., Gertz, H. J. Early neurone loss in Alzheimer’s disease: cortical or subcortical?. Acta Neuropathol Commun. 3, 10 (2015).
- Mesulam, M. The Cholinergic Lesion of Alzheimer’s Disease: Pivotal Factor or The Cholinergic Lesion of Alzheimer’s Disease: Pivotal Factor or Side Show?. Learn Mem. , 43-49 (2004).
- Schliebs, R., Arendt, T. The cholinergic system in aging and neuronal degeneration. Behavioural Brain Research. 221 (2), 555-563 (2011).
- Mesulam, M. M., Mufson, E. J., Wainer, B. H., Levey, A. I. Central cholinergic pathways in the rat: An overview based on an alternative nomenclature (Ch1-Ch6). Neurociência. 10 (4), 1185-1201 (1983).
- Mesulam, M., Mufson, E. J., Levey, A. I., Wainer, B. H. Cholinergic innervation of cortex by the basal forebrain: cytochemistry and cortical connections of the septal area, diagonal band nuclei, nucleus basalis (substantia innominata), and hypothalamus in the rhesus monkey. J Comp Neurol. 214 (2), 170-197 (1983).
- Greenfield, S. Discovering and targeting the basic mechanism of neurodegeneration: The role of peptides from the C-terminus of acetylcholinesterase: Non-hydrolytic effects of ache: The actions of peptides derived from the C-terminal and their relevance to neurodegenerat. Chemico-Biological Interactions. 203 (3), 543-546 (2013).
- Garcia-Ratés, S., et al. (I) Pharmacological profiling of a novel modulator of the α7 nicotinic receptor: Blockade of a toxic acetylcholinesterase-derived peptide increased in Alzheimer brains. Neuropharmacology. 105, 487-499 (2016).
- Eimerl, S., Schramm, M. The quantity of calcium that appears to induce neuronal death. Journal of neurochemistry. 62 (3), 1223-1226 (1994).
- Greenfield, S., Vaux, D. J. Commentary Parkinson’s Disease, Alzheimer’s Disease and Motor Neurone Disease: Identifying a Common Mechanism. Science. 113 (3), 485-492 (2002).
- Badin, A. S., Morrill, P., Devonshire, I. M., Greenfield, S. A. (II) Physiological profiling of an endogenous peptide in the basal forebrain: Age-related bioactivity and blockade with a novel modulator. Neuropharmacology. 105, 47-60 (2016).
- Brai, E., Stuart, S., Badin, A. -. S., Greenfield, S. A. A Novel Ex Vivo Model to Investigate the Underlying Mechanisms in Alzheimer’s Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 291 (2017).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neurociência. 305, 86-98 (2015).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
- Jensen, M. S., Lambert, J. D. C., Johansen, F. F. Electrophysiological recordings from rat hippocampus slices following in vivo brain ischemia. Brain Research. 554 (1-2), 166-175 (1991).
- Ferrati, G., Martini, F. J., Maravall, M. Presynaptic Adenosine Receptor-Mediated Regulation of Diverse Thalamocortical Short-Term Plasticity in the Mouse Whisker Pathway. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-9 (2016).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Badin, A. S., John, E., Susan, G. High-resolution spatio-temporal bioactivity of a novel peptide revealed by optical imaging in rat orbitofrontal cortex in vitro: Possible implications for neurodegenerative diseases. Neuropharmacology. 73, 10-18 (2013).
- Greenfield, S. A., Badin, A. S., Ferrati, G., Devonshire, I. M. Optical imaging of the rat brain suggests a previously missing link between top-down and bottom-up nervous system function. Neurophotonics. 4, 31213 (2017).
- Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic hippocampal slice cultures. Journal of visualized experiments: JoVE. (48), (2011).
- Gong, C. -. X., Lidsky, T., Wegiel, J., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. Metabolically active rat brain slices as a model to study the regulation of protein phosphorylation in mammalian brain. Brain Research Protocols. 6 (3), 134-140 (2001).
