अलगाव और वयस्क Schistosoma japonicum से Extracellular बुलबुले के लक्षण वर्णन
Summary
यहां, हम एक प्रोटोकॉल वर्तमान में extracellular बुलबुले (ईवीएस) अलगाव का वर्णन इन विट्रो में वयस्क Schistosoma japonicumसे प्रसंस्कृत माध्यम ।
Abstract
Extracellular बुलबुले (ईवीएस) Extracellular microenvironment में कोशिकाओं की एक किस्म द्वारा जारी झिल्लीदार बुलबुले हैं । ईवीएस विषम बुलबुले, जिसका आकार ४० और १,००० एनएम के बीच सीमा की आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं । संचित सबूत संकेत दिया कि ईवीएस रोगज़नक़-मेजबान बातचीत में महत्वपूर्ण नियामक भूमिका निभाते हैं । schistosome ईवीएस की गहरी समझ schistosome-मेजबान बातचीत अंतर्निहित तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करना चाहिए, schistosomiasis के खिलाफ उपंयास रणनीतियों के विकास को सक्षम करने । यहां, हम और वयस्क Schistosoma japonicum (एस. japonicum) से ईवीएस के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने से schistosomes में ईवीएस कार्यों का अध्ययन करने का लक्ष्य । ईवीएस से अलग थे इन विट्रो संस्कृति मध्यम केंद्रापसारक एक वाणिज्यिक exosome आइसोलेशन किट के साथ संयुक्त का उपयोग कर । पृथक एस japonicum ईवीएस (SjEVs) आम तौर पर १००-४०० एनएम के एक व्यास के अधिकारी, और संचरण इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी और पश्चिमी सोख्ता द्वारा विशेषता है । PKH67 डाई का उपयोग-लेबल SjEVs प्रदर्शन किया है कि SjEVs प्राप्तकर्ता कोशिकाओं द्वारा आंतरिक हैं । कुल मिलाकर, हमारे प्रोटोकॉल वयस्क schistosomes से ईवीएस को अलग करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका प्रदान करता है; पृथक SjEVs कार्यात्मक विश्लेषण के लिए उपयुक्त हो सकता है ।
Introduction
Extracellular बुलबुले (ईवीएस) विभिन्न प्रोटीन, लिपिड, और न्यूक्लिक एसिड के साथ समझाया छोटे झिल्ली बंधे बुलबुले की आबादी है । हाल के अध्ययनों से प्रदर्शन किया है कि ईवीएस सेल में एक महत्वपूर्ण भूमिका-सेल संचार खेलते हैं, और कई शारीरिक प्रक्रियाओं के विनियमन में शामिल हैं, सेल विकास, प्रतिरक्षा विनियमन, angiogenesis, और सेल माइग्रेशन2सहित, 3,4,5. सबूत जमा इंगित करता है कि ईवीएस, परिचालित exosomes, और उनके miRNA कार्गो कुछ रोगों के संभावित उपमार्क्स6का प्रतिनिधित्व करता है ।
कई प्रोटोजोआ जैसे ट्रायकॉमोनास वेजिनेलिस, Trypanosoma cruzi, और Leishmania एसपीपी., को चुपके से ईवीएस कर दिखाया गया है; helminths इसके अतिरिक्त के लिए रहने वाले में ईवीएस चुपके पाया गया है7मेजबान । परजीवी ईवीएस को संक्रमण के रखरखाव, pathogenicity8, और प्रतिरक्षा विनियमन9में शामिल होना दिखाया गया है । schistosomes में हाल के अध्ययनों से दोनों Schistosoma mansoni (एस. mansoni) 10,11 और एस japonicum12 ने संकेत दिया है कि वयस्क schistosomes स्रावी exosome-बुलबुले की तरह है कि हो सकता है विशिष्ट जैविक प्रक्रियाओं के कार्यात्मक विनियमों में शामिल ।
तिथि करने के लिए, कई तरीकों extracellular बुलबुले अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, ऐसे ultracentrifugation के रूप में, ultrafiltration13, बहुलक आधारित रिएजेंट का उपयोग, आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी, और immunoaffinity अलगाव । इन विभिंन तरीकों के पास अपने स्वयं के फायदे और सीमाएं14। आम तौर पर, ultracentrifugation पुटिका अलगाव के लिए सोने की मानक विधि माना जाता है । हालांकि, इस विधि संभावित EV एकत्रीकरण14की सीमा से ग्रस्त है ।
schistosomes में, EV अलगाव के लिए कुछ विधियों की रिपोर्ट की गई है: इनमें ultracentrifugation11,12,10 और कई चरणों के लिए वाणिज्यिक EV आइसोलेशन किट16 का उपयोग शामिल है (अंडे16, schistosomula११, प्रौढ schistosomes१०,१२,१७). यह देखते हुए कि microvesicles कई सौ nanometers से हजार nanometers के आकार की एक विस्तृत श्रृंखला के हैं, हम एक वैकल्पिक तरीका है कि बेंच केंद्रापसारक, ultrafiltration, और एक वाणिज्यिक EV आइसोलेशन किट के उपयोग के साथ जोड़ती है विकसित से ईवीएस को अलग प्रौढ Schistosoma japonicum. अलग ईवीएस आम तौर पर १००-४०० एनएम के एक व्यास के पास और सफलतापूर्वक प्राप्तकर्ता कोशिकाओं द्वारा आंतरिक थे ।
Protocol
Representative Results
Discussion
ईवीएस पर हाल के अध्ययनों से प्रदर्शन किया है कि schistosome ईवीएस मेजबान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा-रोगज़नक़ बातचीत3,9,12,16। और उनके विनियामक कार्यों को संबोध?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन में भाग या पूरे में, चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित (३१४७२१८७ और ३१६७२५५०) और कृषि विज्ञान और चीनी कृषि विज्ञान अकादमी के प्रौद्योगिकी नवाचार कार्यक्रम था ।
Materials
| Material | |||
| Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 4478359 | For isolating S. japonicum extracellular vesicles |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | For labeling Evs |
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | For parasite culture |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μm syringe filter | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin Dialysis Tubing | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Immobilon™ Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI | Cell Signaling Technology | 4083 | |
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 antibodies | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar/Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Phosphotungstic Acid | Ted Pella | 19402 | |
| anti-mouse IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC clone 1469 cells | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| GE chemoluminescance imaging system | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q water | Milli-Q | Milli-Q Elix | |
| Eppendor Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima L-100 XP Ultracentrifuge | |
| Incubator | ESCO | CCL-107B | |
| Microscope | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 | |
Referências
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