Aqui, apresentamos um protocolo para descrever o isolamento de vesículas extracelulares (EVs) em vitro culta médio de adultos Schistosoma japonicum.
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Artigo de método
Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares de adultos Schistosoma japonicum
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Vesículas extracelulares (EVs) são vesículas membranosas lançadas por uma variedade de células no microambiente extracelular. SVE representa uma população de vesículas heterogêneas, cujo intervalo de tamanho entre 40 e 1.000 nm. Evidências acumuladas indicaram que EVs desempenham importantes funções reguladoras em interações patógeno-hospedeiro. Uma compreensão profunda da esquistossomíase EVs deve fornecer insights sobre os mecanismos subjacentes interações esquistossomíase-host, permitindo o desenvolvimento de novas estratégias contra a esquistossomose. Aqui, pretendemos estudar mais EVs funções em schistosomes apresentando um protocolo para o isolamento e caracterização de EVs de adultos Schistosoma japonicum (S. japonicum). SVE foram isolados em vitro o meio de cultura usando centrifugação combinada com um kit de isolamento exossomo comercial. Os isolados de S. japonicum EVs (SjEVs) normalmente possuem um diâmetro de 100-400 nm e são caracterizadas por microscopia eletrônica de transmissão e mancha ocidental. O uso de PKH67 SjEVs de tingir-etiquetados demonstrou que SjEVs são internalizados pelas células destinatários. No geral, o nosso protocolo fornece um método alternativo para isolar EVs de schistosomes adultos; o SjEVs isolado pode ser adequado para análise funcional.
Introdução
Vesículas extracelulares (EVs) são uma população de pequenas vesículas de membrana-limite encapsulado com várias proteínas, lípidos e ácidos nucleicos. Estudos recentes demonstraram que EVs desempenham um papel crucial na comunicação célula-célula e estão envolvidos na regulação de numerosos processos fisiológicos, incluindo desenvolvimento de célula, regulamento imune, angiogênese e da migração celular2, 3,4,5. Acumular evidências indica que EVs, circulando exosomes e sua carga de miRNA representa potenciais biomarcadores de determinadas d....
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Protocolo
Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê de ética local do Instituto de investigação veterinária de Shanghai, Academia Chinesa de Ciências agrárias (número de licença: SHVRIAU-14-0101).
1. cultura in Vitro de Schistosomes
Nota: Schistosomes representam um risco biológico. Os trabalhadores devem usar luvas de látex vezes quando manipulação vermes, suspensões esquistossomóticos ou outros relacionados com materiais biológicos. Nova Zelândia coelhos foram infectados com cercárias ~ 2.000 via abdominal exposição. Schistosomes na fase hepática fora....
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Resultados
Para quantificar o rendimento de SjEVs isolado usando o protocolo descrito, costumávamos ensaio da proteína BCA para acessar a concentração de proteína da SjEVs isolada de adultos schistosomes 28 dias. Conforme mostrado na tabela 1, a concentração de proteína SjEV variou de 208 µ g a 250 µ g por 100 mL de meio (tabela 1). O tamanho de partícula, conforme determinado pela análise de nanopartículas de Malvern, indicou que o isolado SjEVs variou de 100 nm a .......
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Discussão
Estudos recentes sobre EVs têm demonstrado que esquistossomíase que EVS desempenham um papel importante nas interações patógeno-hospedeiro3,9,12,de16. Para endereço ainda mais suas funções reguladoras, é essencial para isolar EVs de schistosomes. Aqui, descrevemos um método alternativo para SjEV isolamento. Este método produz um tamanho de ampla gama de SjEVs, de 100 nm a 400 nm, em adultos
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este estudo foi, em parte ou no todo, suporte Nacional Natural Science Foundation da China (31472187 e 31672550) e a ciência agrícola e programa de inovação de tecnologia da Academia Chinesa de Ciências agrárias.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Material | |||
| Reagente de isolamento de exossomos totais (a partir de meios de cultura de células) | ThermoFisher 4478359 CIENTÍFICO | Para isolar vesículas extracelulares de S. japonicum | |
| PKH67 | Sigma-aldrich | MINI67 | Para rotulagem Evs |
| RPMI 1640 Médio | ThermoFisher SCIENTIFIC | 11875119 | Para cultura de parasitas |
| Penicilina-Estreptomicina | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15140122 | |
| 0.22μ Filtro de seringa M | Merck | SLGP033RB | |
| SnakeSkin | Thermo SCIENTIFIC | 68035 | |
| PEG8000 | Sangon Biotech | A100159 | |
| RIPA | Beyotime | P0013B | |
| EMD Millipore™ Imóveis&comércio; Substrato de HRP Quimioluminescente Ocidental (ECL) | Fisher scientific | WBKLS0100 | |
| DAPI Cell Signaling Technology | 4083 | ||
| BCA kit | Beyotime | P0010 | |
| CD63 anticorpos | Sangon Biotech | D160973-0025 | |
| PVDF | Bio-Rad | 1704273 | |
| Formvar / Carbon 400 mesh | Ted Pella | 01754-F | |
| Ácido fosfotúngstico | Ted Pella | 19402 | |
| clone anti-camundongo IgG-HRP | CWBIO | CW0102 | |
| NCTC 1469 células | ATCC | ATCC® CCL-9.1™ | |
| FBS | HyClone | SV30087.02 | |
| Equipments | |||
| imagem de imagem de quimioluminescência | GE | ImageQuant LAS4000mini | |
| Microscopia eletrônica de transmissão | Hitachi | H-7600 | |
| Milli-Q água | Milli-Q Milli-Q | Elix | |
| Eppendor Centrífuga | Centrífuga Eppendorf | 5804R | |
| Zetasizer Nano | Malvern | Zetasizer Nano ZS | |
| Ultracentrífuga | Beckman | Optima L-100 XP Incubadora de Ultracentrífuga | |
| ESCO | CCL-107B | ||
| Microscópio | Zeiss | Zeiss Axin Observer Z1 |
Referências
- Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication. Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).
- Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to ....
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Reimpressões e permissões
