Desthiobiotin-Streptavidin-afinidade mediada purificação de proteínas RNA-interagindo em células mesotelioma

Resumo

Desthiobiotin rotulagem de um sintético 25-nucleotide oligo de RNA, que contém um motivo de adenina-rico elemento (são), permite a ligação específica da proteína de ligação são citosólica.

Resumo

O em vitro RNA-pulldown é ainda amplamente usado nos primeiros passos de protocolos que visam identificar RNA-proteínas que reconhecem estruturas de RNA e motivos específicos. Neste protocolo de RNA-pulldown, sondas de RNA sintetizadas comercialmente são rotuladas com uma forma modificada de biotina, desthiobiotin, no terminal 3' da strand, RNA, que se liga reversivelmente para streptavidin e permite assim a eluição das proteínas sob mais fisiológica condições. O RNA-desthiobiotin está imobilizado através da interação com estreptavidina em grânulos magnéticos, que são usados para puxar para baixo de proteínas que interagem especificamente com o RNA de interesse. Proteínas não-desnaturado e ativas da fracção citosólica de células mesotelioma são utilizadas como fonte de proteínas. O método descrito aqui pode ser aplicado para detectar a interação entre proteínas de ligação de RNA conhecidas e uma 25-nucleotide (nt) longo RNA sonda contendo uma sequência de interesse. Isso é útil para completar a caracterização funcional de estabilização ou desestabilizar os elementos presentes em moléculas de RNA alcançadas usando um ensaio de vetor de repórter.

Introdução

Expressão gênica e o nível final do produto do gene podem ser fortemente regulamentados por afetar a estabilidade do mRNA e o mRNA tradução taxa¹. Estes mecanismos de regulação pós-transcricional são exercidos através de interações de não-codificantes do RNA e/ou ligação de RNA proteínas (RBPs) com mRNA alvo. Geralmente é a região untranslated 3' do mRNA (3' UTR - pertencentes à porção não-codificantes do genoma²) que contém específica cis-elementos reguladores (CRE), que são reconhecidos pelo trans-agindo fatores como miRNA ou RBPs ³. o mais bem estudadas cis-elemento d....

Protocolo

1. preparação da fração de proteína citosólica e Nuclear

1. Placa 4 x 10⁶ ACC-MESO-4 células num balão de cultura de célula T150 cultivadas em RPMI - 1640 meio suplementado com 10% FBS, 1 x penicilina/estreptomicina (100 x) e 2 mM L-glutamina (200 mM). Quando as células alcançam uma confluência de 80-90% (~5-5.5 x 10⁶ células), prosseguir com a extração da proteína da fração nuclear e citosólica.
   Nota: ACC-MESO-4 linha de celular foi obtida o RIKEN BioResource centro¹¹.
2. Aspire médio, lavar as células adicionando-se 15 mL de 1X PBS, incline a placa suavemente algumas vezes e aspire a PBS 1x. Adicionar 3 ....

Resultados

Neste experimento, utilizou-se um fragmento de tempo 25-nt de desnutridos 3' UTR abrigando são motivo (CALB2) 3' UTR (são) 25-nt para testar se liga-se especificamente à proteína antígeno humano-R (HuR), um conhecido estabilizador de mRNA. Para testar a especificidade do elemento são, um RNA 25-nt sonda CALB2 3' UTR (mtARE) contendo uma mutação são-motivo, que anteriormente foi mostrada para abolir o efeito de estabilização do motivo são, foi usado⁶. O RNA terceiro.......

Discussão

3' UTRs pertencem ao não-codificantes do genoma³, e todos os RNAs não codificantes podem interagir com as proteínas a fim de exercer sua função⁷. Quando o genoma de mamíferos foi encontrado para ser comodamente transcrito e produzido uma parcela significativa de tempo não-codificante RNAs¹⁶, emergentes evidências demonstraram que estes RNAs long-não-codificante função na regulação da expressão gênica como eles interagem com cromatina-remodelação comp.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
NE-PER Kit de extração nuclear e citoplasmática	Thermo Fisher Scientific	78833
Comprimidos Inibidores de Protease Pierce, sem EDTA	Thermo Fisher Scientific	A32965
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	23225
Pierce Magnetic RNA-protein Pull-Down	Thermo Fisher Scientific	20164	Inclui contas magnéticas e, portanto, o kit precisa ser armazenado a 4 &graus; C
Perfurar RNA 3' Kit de Destiobiotinilação Fim	Thermo Fisher Scientific	20163	O kit faz parte do "Kit Pull-Down de RNA-proteína magnética Pierce", e precisa ser armazenado a -20 &graus; C ao contrário do kit pull-down (4 ° C).
Suporte magnético DynaMag-2,		Thermo Fisher
		Scientific-O	anticorpo está incluído no Kit Pull-Down de RNA-proteína magnética Pierce  - 1:1000 in 5% BSA 1x TTBS - anticorpo secundário anti-rato coelho 1:10,000 in 5% BSA 1x TTBS
Anti - α - tubulina (MOUSE) anticorpo monoclonal	Santa Cruz	8035	1:1000 em 5% BSA 1x TTBS - anticorpo secundário anti-camundongo coelho 1:10.000 em 5% BSA 1x TTBS
Anti - PARP (COELHO) Anticorpo policlonal	Sinalização Celular	9542	1:1000 em 5% BSA 1x TTBS - anticorpo secundário anti-coelho de cabra 1:10.000 em 5% BSA 1x TTBS
Anti - Mesotelina (MOUSE) Anticorpo Monoclonal	Rockland	200-301-A87
Anticorpo secundário anti-coelho para cabras	Sinalização Celular	7074
Anticorpo secundário anti-rato para coelhos	Sigma-Aldrich	A-9044
RPMI - 1640 medium	Sigma-Aldrich	R8758
FBS - Soro Bovino Filtrado	Pan Biotech	P40-37500
Penicilina - estreptomicina (100x)	Sigma-Aldrich	P4333
Solução de L-Glutamina (200 mM)	Sigma-Aldrich	G7513
0.25% Tripsina-EDTA (1x)	Gibco da Life technologies	25200-056
Mini-PROTEAN 3 Cell	Bio-Rad	1653301
Mini Protean System Placas de Vidro	Placas	Bio-Rad 1653308
Mini-PROTEAN com espaçador integrado de 1,5 mm	Mini-PROTEAN 1653312		Bio-Rad
, 10 poços, 1,5 mm, 66 µ L	Bio-Rad	1653365
Mini-PROTEAN Tetra Cell Casting Modules	Bio-Rad	1658050
RNaseZap Solução de Descontaminação RNase	Thermo Fisher Scientific	AM9780
Rotiphorese gel 30 - solução estoque aquosa de 30% de acrilamida e bisacrilamida na proporção de 37.5:1	Roth	3029
20% SDS	PanReac AppliChem	A3942
PVDF	Perkin Elmer	NEF1002	Precisa ser ativado incubando em metanol puro por 1 min seguido de lavagem em água por 2 min
Célula de transferência semi-seca Trans-Blot SD	Bio-Rad	1703940
Clareza Western ECL Substrate	Bio-Rad	1705061
FusionFX  Imager Digital	Vilber-RNA
oligo synthesis	Mycrosynth AG,	Suíça-a	escala de síntese - 0.04 µ mol - Albumina
de soro bovino	Sigma-Aldrich	A7030
Ácido clorídrico (HCl) 6 M	PanReac AppliChem	182883.1211
Ultra Pure 1 M Tris, pH 7.5	Thermo Fisher Scientific	15567027
Glicerol	Thermo Fisher Scientific	17904	Alíquotas 50% estéreis para serem armazenadas a -20° C
Pierce Streptavidin contas magnéticas	Thermo Fisher Scientific	88817	Por favor, note que estas contas magnéticas têm um diâmetro médio de 1 µ m (intervalo de 0,5 - 1,5 µ m). Além disso, Dynabeads-M280 Streptavidin, que são grânulos de tamanho homogêneo 2,8 µ m, também são usados no pulldown de RNA, mas esteja ciente de que isso pode afetar o processo de purificação.
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281
Persulfato de amônio	Sigma-Aldrich	A3678
Coomassie G-250	Applichem	A3480
Aluminiumsulfate-(14-18)-hydrate	Sigma-Aldrich	368458
ácido ortofosfórico	Aplicativo	A0637

Anticorpo monoclonal Anti-HuR (MOUSE) Anti-HuR da Espaçadoras Pente Membrana de transferência purificada por HPLC