哺乳類の Mrna の翻訳開始複合体形成の Toeprinting 分析
Summary
体外の能力を計測する Toeprinting の目的は、リボソームさまざまな条件の下でフォームの翻訳開始複合体に RNA を転写しました。このプロトコルは toeprinting 哺乳類の RNA のための方法を記述してキャップ依存、IRES 駆動の両方の翻訳を勉強する使用ことができます。
Abstract
翻訳開始は、タンパク質合成の律速段階で細胞でタンパク質出力を調節する重要なポイントを表します。タンパク質合成の調節は、細胞のストレス応答するキーと不全、癌などの多くの病気の状態の中心。例えば、帽子独立した方法で細胞ストレスは減衰キャップ依存主導によるグローバル翻訳の阻害につながるが、特定のストレス応答タンパク質群選択的に変換されます。これらの特定の Mrna の翻訳のため、細胞内部リボソームのエントリ サイト (沢のカキツバタ) などの控えめな RNA 規制要素を許可します。このような Mrna の同定とそれらの調節機構の解析、分子生物学の主要な領域をされています。翻訳開始に関連した、Toeprinting、RNA の構造と機能の研究の方法です。Toeprinting の目標は体外の能力を評価するためにどのシーケンス、構造要素、またはアクセサリー要因がリボソームに関与しているを決定するためにさまざまな条件下でリボソームと安定な錯体を形成する RNA を転写バインド-効率的な翻訳開始前のカーソル。西部の分析やポリソームのプロファイリングなどの他の技術と一緒に翻訳開始制御機構の堅牢な特性の toeprinting ことができます。
Introduction
翻訳は、ほとんどの携帯電話のエネルギーを消費すると厳しく規制された1を翻訳には理にかなって。逆に、翻訳の制御不全- とタンパク質出力の結果として変化-がん1,2などのストレス応答と疾患の状態が多くみられます。翻訳調節の主な利点は、細胞が様々 な刺激3に対応するため、タンパク質の出力を変更することが速度です。翻訳の規制はこのように細胞の生存と死1,2,3に影響を与えることができる重要なメカニズムを表します。翻訳の手順の開始はほとんど高度規制で複雑な3です。簡単に言えば、真核生物の Mrna には翻訳のために不可欠であるほとんど常に 5′ m7G キャップが含まれています。真核生物の開始因子 eIF4E、eIF4A、eIF4G 帽子依存した開始が必要です (キャップ認識複合体) の mRNA の 5′ 端と対話します。43 細胞リボソーム複雑、eIF2 バインド イニシエーターを含む tRNA および eIF3、mRNAを介してeIF3 と eIF4G の相互作用の 5′ 端に募集しています。開始前複合体は eIF4A 援用 mRNA をスキャンすると思った (RNA ヘリカーゼ) 開始コドン (AUG) が見つかるまで。48 s 開始複合体が形成されその後、tRNA はリボソームの P サイトに配信。最後に、60 s と 40 s リボソームのサブユニットは翻訳伸長1,3,4に続いて 80 年代開始複合体の形成に統一されています。対照的に、内部リボソームのエントリ サイト (沢のカキツバタ) は、開始コドン3に直接 subunit 40 代を募集して 5′ キャップの要件をバイパスします。生理的ストレス条件キー一般的な真核生物の開始因子 (eIFs) の変更による mRNA 翻訳を減衰させます。しかし、ストレス応答タンパク質をエンコードよく特定の Mrna の選択的な翻訳を可能にする非正規翻訳開始機構、癌のような病気の状態で非正規翻訳開始の破綻が関与して1,2。 細胞の沢のカキツバタなど、控えめな RNA 規制要素32,などの Mrna の翻訳を可能にします。
翻訳調節の 1 つの特に興味深い側面は、正規と非正規の特定の mRNA の翻訳のメカニズムを理解することです。Toeprinting は、特定の Rnaの生体外の翻訳開始機構の詳細な解明ができるテクニックです。Toeprinting の全体的な目標はどのシーケンス、構造要素またはアクセサリーを決定するために翻訳開始さまざまな条件下でリボソーム複合体の形成を核に関心の RNA の能力を評価するには要因は、効率的な翻訳開始に必要です。たとえば、リボソーム募集を 5′ キャップの不在で妨げが、IRES の存在によって刺激があります。
技術の原理は体外にある開始複合体フォーム、し、逆に書き写すように翻訳のコンポーネント (または浄化されたコンポーネント) を含む細胞抽出物の存在下でそれを孵化、関心の RNA を転写特定のプライマー RNA。安定 RNA リボソーム複合体にはリボソームのいわゆる ‘toeprint’5,6、7の 3′ 端に失速する逆のトランスクリプションが原因となります。
このプロトコル、ribosomal 亜単位、eIFs、Trna、IRESトランスで-因子 (ITAFs) は便利なウサギ網状赤血球ライセート (RRL) に寄贈します。このプロトコルの別の利点は、標識プライマーではなく、蛍光標識したプライマーとジェル ベースの蛍光イメージャの使用です。これは、プライマーを標識化と同様にゲルを乾燥増に公開するなど、追加の手順を排除します。蛍光バンドより高い解像度を可能にするゲルの実行中に、リアルタイムに記録されます。アポトーシス蛋白 (XIAP) IRES RNA の上限なし X リンク阻害剤は、キャップ Mrna はこのテクニック8でも分析できますがここでは、例として使用されます。
セル lysates の翻訳プロセスの最終的な出力を測定する西部の分析とは異なり toeprinting、RNA の翻訳開始複合体形成を測定するための in vitroアプローチです。この還元主義的アプローチは、基板や翻訳開始因子の非常に詳細な研究 (e.g、キャップまたは国連おおわれた mRNA IRES の構造、有無、ポリ A の尾、特定の蛋白質の要因の規定の。など)。したがって、翻訳8のさまざまなモードや mRNA の構造の沢のカキツバタなどタンパク質合成9,10の効果を研究する toeprinting を使用できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
Toeprinting は、高度に制御された状況下での翻訳開始複合体の形成を支援する目的の RNA の能力を直接測定する強力な手法です。このプロトコルは toeprinting の簡略化手法を記述する哺乳類の Rna。ウサギ網状赤血球ライセート (RRL)、リボソーム、eIFs、イニシエーターの便利なソースとして使用されます、tRNA、IRESトランス-要因 (ITAFs) の演技します。実験者は選択の彼らの RNA を提供し、自…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
イノベーション ジョン r. エヴァンス リーダー基金 (35017)、キャンパス アルバータ州革新プログラムおよびアルバータ州省の自然科学と工学研究会のカナダ発見助成 (RGPIN-2017-05463)、カナダの財団によって資金が供給されたこの作品経済発展と貿易。
Materials
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sucrose, molecular biology grade | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| 500mL bottle top filtration units, 0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamide | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (disodium salt, dihydrate) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| Xylene cyanol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 transcription kit | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit | Ambion | AM1344 | |
| Acid Phenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. | Green Hectares, USA | Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Mix equal parts for a stock of 25 mM each. |
| AMV-RT, 10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA analyzer | LI-COR | Product has been discontinued | |
| APS (Ammonium Persulfate) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
Referências
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