स्तनधारी mRNAs पर अनुवाद दीक्षा परिसर गठन का Toeprinting विश्लेषण
Summary
Toeprinting की क्षमता को मापने के लिए इन विट्रो प्रतिलिखित आरएनए की शर्तों के एक किस्म के तहत ribosomes के साथ अनुवाद दीक्षा परिसरों फार्म करने के लिए करना है । इस प्रोटोकॉल toeprinting स्तनधारी आरएनए के लिए एक विधि का वर्णन है और दोनों टोपी पर निर्भर है और आयरेस-चालित अनुवाद का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Abstract
अनुवाद दीक्षा दर-प्रोटीन संश्लेषण की सीमित कदम है और एक महत्वपूर्ण बिंदु है जिस पर कोशिकाओं को अपने प्रोटीन उत्पादन को विनियमित का प्रतिनिधित्व करता है । प्रोटीन संश्लेषण के विनियमन सेलुलर तनाव प्रतिक्रिया की कुंजी है, और dysregulation कैंसर के रूप में कई रोग राज्यों के लिए केंद्रीय है । उदाहरण के लिए, हालांकि सेलुलर तनाव टोपी पर निर्भर दीक्षा क्षीणन द्वारा वैश्विक अनुवाद के निषेध की ओर जाता है, कुछ तनाव प्रतिक्रिया प्रोटीन चुनिंदा एक टोपी स्वतंत्र तरीके से अनुवाद कर रहे हैं । विचारशील आरएनए विनियामक तत्व, जैसे सेलुलर आंतरिक ribosome प्रविष्टि साइटें (IRESes), इन विशिष्ट mRNAs के अनुवाद के लिए अनुमति देते हैं । ऐसे mRNAs की पहचान, और उनके विनियामक तंत्र के लक्षण वर्णन, आणविक जीवविज्ञान में एक महत्वपूर्ण क्षेत्र रहा है । Toeprinting आरएनए संरचना और समारोह के अध्ययन के लिए एक विधि के रूप में यह अनुवाद दीक्षा से संबंधित है । toeprinting का लक्ष्य है की क्षमता का आकलन करने के लिए इन विट्रो में ribosomes के साथ स्थिर परिसरों के रूप में शर्तों की एक किस्म है, जो निर्धारित करने के क्रम में, संरचनात्मक तत्वों, या गौण कारकों ribosome में शामिल हैं बाध्यकारी-एक पूर्व कुशल अनुवाद दीक्षा के लिए कर्सर । जैसे पश्चिमी विश्लेषण और polysome रूपरेखा के रूप में अंय तकनीकों, के साथ, toeprinting अनुवाद दीक्षा के विनियमन के लिए तंत्र का एक मजबूत लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है ।
Introduction
अनुवाद के रूप में सबसे सेलुलर ऊर्जा की खपत, यह समझ में आता है कि अनुवाद कसकर1विनियमित है । इसके विपरीत, अनुवाद के dysregulation-और प्रोटीन उत्पादन में फलस्वरूप परिवर्तन-अक्सर तनाव में मनाया जाता है-प्रतिक्रिया और रोग राज्यों, जैसे कि कैंसर1,2। शोधों के नियंत्रण का एक प्रमुख लाभ वह गति है जिसके साथ विभिन्न उत्तेजनाओं का जवाब देने के लिए कोशिकाएं अपने प्रोटीन उत्पादन को बदल सकती हैं3. अनुवाद विनियमन इस प्रकार एक महत्वपूर्ण तंत्र है कि सेल अस्तित्व और मौत1,2,3को प्रभावित कर सकते है का प्रतिनिधित्व करता है । अनुवाद के चरणों का, दीक्षा सबसे उच्च विनियमित और जटिल3है । संक्षेप में, सबसे eukaryotic mRNAs एक 5 ‘ एम7जी टोपी है कि लगभग हमेशा उनके अनुवाद के लिए आवश्यक है होते हैं । टोपी पर निर्भर दीक्षा eukaryotic दीक्षा कारकों eIF4E, eIF4A, और eIF4G (टोपी मान्यता जटिल) के लिए mRNA के 5 ‘ अंत के साथ बातचीत करने की आवश्यकता है. 43S दीक्षा ribosome परिसर, जिसमें eIF2-बाउंड सर्जक tRNA और eIF3 हैं, mRNA के साथ eIF4G के एक इंटरैक्शन के माध्यम से eIF3 के 5 ‘ अंत में भर्ती की जाती है. दीक्षा परिसर में mRNA स्कैन करने के लिए सोचा है, eIF4A द्वारा सहायता प्राप्त (एक आरएनए helicase) जब तक शुरू codon (AUG) स्थित है । बाद में 48S दीक्षा परिसर का गठन किया जाता है और tRNA को ribosome के पी-साईट में दिया जाता है । अंत में, 60 के दशकों और 40 ribosome उपइकाइयों के लिए 80 के दशक दीक्षा परिसर के रूप में एकजुट हैं, अनुवाद बढ़ाव1,3,4के बाद । इसके विपरीत, आंतरिक ribosome प्रवेश साइटों (IRESes) 40 राइबोसोमल उपइकाई की भर्ती द्वारा एक 5 ‘ टोपी के लिए सीधे दीक्षा codon3के लिए आवश्यकता बाईपास । शारीरिक तनाव की स्थिति के प्रमुख सामांय eukaryotic दीक्षा कारकों (eIFs) के संशोधनों के कारण वैश्विक mRNA अनुवाद क्षीण करना । तथापि, गैर-विहित अनुवाद दीक्षा तंत्र कुछ mRNAs के चुनिंदा अनुवाद के लिए अनुमति देते हैं, जो अक्सर तनाव-प्रतिसाद प्रोटीन को एनकोड करते हैं, और गैर-विहित अनुवाद दीक्षा के dysregulation कैंसर जैसे रोग राज्यों में फंसाया जाता है 1 , 2. विचारशील आरएनए विनियामक तत्व, जैसे सेलुलर IRESes, इस तरह के mRNAs के अनुवाद के लिए अनुमति देते हैं2,3.
अनुवाद नियंत्रण का एक विशेष रूप से दिलचस्प पहलू के लिए विहित बनाम गैर के तंत्र को समझने की है एक दिया mRNA के विहित अनुवाद । Toeprinting एक तकनीक है कि इन विट्रो मेंविशिष्ट RNAs के अनुवाद दीक्षा के विस्तृत यंत्रवत अध्ययन की अनुमति देता है । toeprinting के समग्र लक्ष्य के लिए ब्याज की एक आरएनए की क्षमता का आकलन करने के लिए एक किस्म की शर्तों के तहत ribosome के साथ एक अनुवाद दीक्षा परिसर के गठन nucleate है, क्रम में निर्धारित करने के लिए जो अनुक्रम, संरचनात्मक तत्वों, या गौण कारक कुशल अनुवाद दीक्षा के लिए आवश्यक हैं । उदाहरण के लिए, ribosome भर्ती एक 5 ‘ टोपी के अभाव में बाधा हो सकती है, लेकिन एक आयरेस की उपस्थिति से प्रेरित ।
तकनीक के सिद्धांत को इन विट्रो में ब्याज की एक आरएनए टाइप करना है, यह सेलुलर निष्कर्षों की उपस्थिति में अनुवाद घटकों (या शुद्ध घटकों) युक्त दीक्षा परिसरों के रूप में अनुमति है, और टाइप रिवर्स एक विशिष्ट प्राइमर के साथ आरएनए । स्थिर आरएनए-ribosome परिसरों रिवर्स प्रतिलेखन के लिए ribosome के ‘ 3 किनारे पर स्टाल का कारण होगा-तथाकथित ‘ toeprint ‘5,6,7।
इस प्रोटोकॉल में, राइबोसोमल उपइकाईयों, eIFs, tRNAs, और आयरेस ट्रांसअभिनय कारकों (ITAFs) सुविधाजनक रूप से खरगोश reticulocyte lysate (RRL) द्वारा योगदान कर रहे हैं । इस प्रोटोकॉल का एक और लाभ एक फ्लोरोसेंट-लेबल प्राइमर और प्रतिदीप्ति जेल आधारित imager के उपयोग के बजाय एक radiolabeled प्राइमर है । यह radiolabeling प्राइमर सहित अतिरिक्त कदम, समाप्त, साथ ही जेल सुखाने और यह एक तेज स्क्रीन को उजागर । फ्लोरोसेंट बैंड वास्तविक समय में दर्ज कर रहे हैं, जेल के रूप में चलाता है, अधिक से अधिक संकल्प के लिए अनुमति दी । apoptosis प्रोटीन (XIAP) आयरेस आरएनए के अनढकी एक्स-लिंक्ड अवरोधक यहां एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है, हालांकि छाया mRNAs भी इस तकनीक8द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है ।
पश्चिमी विश्लेषण, जो सेल lysates में अनुवाद की प्रक्रिया के अंतिम उत्पादन उपायों के विपरीत, toeprinting एक इन विट्रो दृष्टिकोण में एक आरएनए पर अनुवाद दीक्षा जटिल गठन को मापने के लिए है । इस गुटबंदी दृष्टिकोण सब्सट्रेट या कारकों है कि अनुवाद दीक्षा को विनियमित के अत्यधिक विस्तृत अध्ययन के लिए अनुमति देता है (उदा, छाया हुआ या संयुक्त राष्ट्र छाया हुआ mRNA, आयरेस संरचना, उपस्थिति या पाली की अनुपस्थिति-एक पूंछ, विशिष्ट प्रोटीन कारकों का प्रावधान, आदि। इसलिए, toeprinting अनुवाद के विभिंन तरीकों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है8 या IRESes के रूप में mRNA संरचनाओं के प्रभाव, प्रोटीन संश्लेषण9,10पर ।
Protocol
Representative Results
Discussion
Toeprinting एक शक्तिशाली तकनीक को सीधे ब्याज की एक आरएनए की क्षमता को मापने के लिए उच्च नियंत्रित परिस्थितियों में अनुवाद दीक्षा परिसरों के गठन का समर्थन है । इस प्रोटोकॉल toeprinting स्तनधारी RNAs के लिए एक सरलीकृत तक…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एक प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान कनाडा के परिषद द्वारा वित्त पोषित किया गया-डिस्कवरी अनुदान (RGPIN-2017-05463), अभिनव के लिए कनाडा फाउंडेशन-जॉन आर इवांस नेताओं कोष (३५०१७), परिसर अलबर्टा नया कार्यक्रम और अलबर्टा मंत्रालय के आर्थिक विकास और व्यापार ।
Materials
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sucrose, molecular biology grade | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| 500mL bottle top filtration units, 0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamide | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (disodium salt, dihydrate) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| Xylene cyanol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 transcription kit | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit | Ambion | AM1344 | |
| Acid Phenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. | Green Hectares, USA | Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Mix equal parts for a stock of 25 mM each. |
| AMV-RT, 10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA analyzer | LI-COR | Product has been discontinued | |
| APS (Ammonium Persulfate) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
Referências
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