Toeprinting analisi di traduzione Iniziazione formazione complessa su mRNAs mammiferi
Summary
Toeprinting mira a misurare la capacità in vitro di trascritti di RNA per formare complessi di inizio di traduzione con i ribosomi in una varietà di condizioni. Questo protocollo descrive un metodo per toeprinting RNA dei mammiferi e può essere usato per studiare traduzione cap-dipendente sia IRES-driven.
Abstract
L’inizio della traduzione è la tappa limitante della sintesi proteica e rappresenta un punto chiave in cui le cellule regolano la loro produzione di proteine. Regolamento della sintesi proteica è la chiave di risposta allo stress cellulare, e disregolazione è centrale rispetto a molti Stati di malattia, come il cancro. Per esempio, anche se stress cellulare porta all’inibizione della traduzione globale di attenuante inizio PAC-dipendente, determinate proteine di risposta allo stress sono selettivamente tradotto in modo indipendente dal tappo. Elementi regolatori di RNA discreti, ad esempio siti di voce cellulare ribosoma interna (IRESes), consentono per la traduzione di questi specifici mRNA. Identificazione di tali mRNA e la caratterizzazione dei loro meccanismi di regolazione, sono stati un’area chiave nella biologia molecolare. Toeprinting è un metodo per lo studio della funzione e della struttura del RNA per quanto concerne l’inizio della traduzione. L’obiettivo di toeprinting è per valutare la capacità in vitro di trascritti di RNA per formare complessi stabili con i ribosomi in una varietà di condizioni, al fine di determinare quali sequenze, elementi strutturali o accessori fattori sono coinvolti in ribosoma associazione — un pre-cursore per l’inizio della traduzione efficiente. Accanto a altre tecniche, quali analisi occidentale e polisoma profilatura, toeprinting permette per una robusta caratterizzazione dei meccanismi per la regolazione dell’inizio di traduzione.
Introduction
Come traduzione consuma energia più cellulare, ha senso che la traduzione è strettamente regolato1. Al contrario, disregolazione della traduzione- e le conseguenti alterazioni nell’output di proteina-è spesso osservata negli Stati di risposta allo stress e malattia, ad esempio cancro1,2. Dei principali vantaggi del controllo traduzionale è la velocità con cui le cellule possono alterare la loro produzione di proteine al fine di rispondere a vari stimoli3. Regolamento di traduzione rappresenta quindi un meccanismo importante che può influenzare la sopravvivenza delle cellule e morte1,2,3. I passaggi di traduzione, l’iniziazione è la maggior parte altamente regolamentato e complesso3. Brevemente, il mRNA eucariotico più contenga un cappuccio di7G m di 5′ è quasi sempre essenziale per la loro traduzione. Inizio PAC-dipendente richiede iniziazione eucariotica fattori eIF4E, eIF4A ed eIF4G (il complesso cap-riconoscimento) di interagire con l’estremità 5′ del mRNA. 43S preinitiation ribosoma complesso, che contiene eIF2 associato iniziatore tRNA ed eIF3, viene reclutato all’estremità 5′ del mRNA tramite un’interazione di eIF4G con eIF3. Il complesso di preinitiation è pensato per eseguire la scansione mRNA, aiutato da eIF4A (un RNA elicasi) fino a quando il codone di inizio (AUG) si trova. Successivamente si forma il complesso d’inizio 48S e tRNA viene consegnato al sito P del ribosoma. Infine, le subunità ribosomiale 60S e 40S sono unite per formare il complesso, d’inizio anni ‘ 80 seguito da traduzione allungamento1,3,4. Al contrario, siti di internal ribosome entry (IRESes) bypassare il requisito per un cappuccio 5′ reclutando la subunità ribosomiale 40S direttamente per il codone di inizio3. Condizioni di stress fisiologico attenuano la traduzione di mRNA globale a causa di modifiche di fattori chiave di iniziazione eucariotica generale (eIFs). Tuttavia, meccanismi di iniziazione di traduzione non canonico consentono una traduzione selettiva di alcuni mRNA che codificano spesso proteine di risposta allo stress e disregolazione dell’inizio di traduzione non canonico è implicato negli Stati di malattia come il cancro 1 , 2. elementi regolatori discreti RNA, come IRESes cellulare, consentono per la traduzione di questi mRNAs2,3.
Un aspetto particolarmente interessante del controllo traduzionale è quello di comprendere i meccanismi della canonica contro traduzione non canonico di un dato mRNA. Toeprinting è una tecnica che permette lo studio meccanicistico dettagliato di inizio di traduzione di specifici RNA in vitro. L’obiettivo generale del toeprinting è quello di valutare la capacità di un RNA di interesse di nucleazione la formazione di un complesso con il ribosoma sotto una varietà di condizioni, l’inizio della traduzione al fine di determinare quali sequenze, elementi strutturali o dell’accessorio fattori sono necessari per l’inizio della traduzione efficiente. Per esempio, ribosoma assunzione potrebbe essere ostacolato in assenza di un cappuccio 5′ ma stimolato dalla presenza di un IRES.
Il principio della tecnica è quello in vitro trascrivere un RNA di interesse, viene quindi incubato in presenza di estratti cellulari contenenti componenti di traduzione (o le componenti purificate) per consentire a trascrivono complessi di iniziazione per forma e per invertire il RNA con un primer specifico. Complessi RNA-ribosoma stabili causerà la trascrizione inversa di stallo all’estremità 3′ del ribosoma, il cosiddetto ‘toeprint’5,6,7.
In questo protocollo, le subunità ribosomali, eIFs, tRNAs e IRES trans-fattori agenti (ITAFs) sono convenientemente fornite da lysate del reticulocyte del coniglio (RRL). Un altro vantaggio di questo protocollo è l’utilizzo di un primer marcato fluorescente e imager di gel a base di fluorescenza, piuttosto che un primer radiomarcato. Questo Elimina passaggi aggiuntivi, tra cui radiolabeling il primer, come pure asciugare il gel ed esporla ad uno schermo d’intensificazione. Le bande fluorescenti sono registrate in tempo reale, durante l’esecuzione del gel, consentendo una maggiore risoluzione. Scoperchiata inibitore X-linked di apoptosi (XIAP) proteina IRES RNA viene utilizzato come esempio qui, anche se capped mRNA può essere analizzata anche da questa tecnica8.
A differenza di analisi occidentale, che misura l’output finale del processo di traduzione in lisati cellulari, toeprinting è un approccio in vitro per misurare la formazione complessa di iniziazione di traduzione su un RNA. Questo approccio riduzionista consente lo studio altamente dettagliato di substrati o fattori che regolano l’inizio della traduzione (ad es., ridotta o ONU-capped mRNA, IRES struttura, presenza o assenza di coda poli-A, fornitura di fattori proteici specifici, ecc.). Quindi, toeprinting può essere utilizzato per studiare le diverse modalità di traduzione8 o gli effetti delle strutture di mRNA, come IRESes, su proteina sintesi9,10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Toeprinting è una tecnica potente per misurare direttamente la capacità di un RNA di interesse per sostenere la formazione dei complessi di inizio traduzione in circostanze altamente controllate. Questo protocollo descrive una tecnica semplificata per toeprinting mammiferi RNAs. Reticolociti di coniglio lisato (RRL) viene utilizzato come una comoda fonte di ribosomi, eIFs, iniziatore tRNA e IRES trans-in qualità di fattori (ITAFs). Lo sperimentatore fornisce loro RNA di scelta e può anche completare la reazi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato da un scienze naturali e ingegneria Research Council del Canada-Discovery Grant (RGPIN-2017-05463), la Fondazione canadese per fondo di innovazione-John R. Evans leader (35017), il programma di Innova Alberta Campus e il Ministero di Alberta di Sviluppo economico e commercio.
Materials
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sucrose, molecular biology grade | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| 500mL bottle top filtration units, 0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamide | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (disodium salt, dihydrate) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| Xylene cyanol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 transcription kit | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit | Ambion | AM1344 | |
| Acid Phenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. | Green Hectares, USA | Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Mix equal parts for a stock of 25 mM each. |
| AMV-RT, 10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA analyzer | LI-COR | Product has been discontinued | |
| APS (Ammonium Persulfate) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
Referências
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