Toeprinting analyse van vertaling initiatie complexvorming op zoogdieren mRNAs
Summary
Toeprinting wil het vermogen meten van in vitro Getranscribeerd RNA naar formulier vertaling initiatie complexen met ribosomen onder een aantal voorwaarden. Dit protocol wordt een methode beschreven voor de toeprinting zoogdieren RNA en kan worden gebruikt voor het bestuderen van de GLB-afhankelijke zowel IRES gestuurde vertaling.
Abstract
Inleiding van de vertaling is de snelheidslimieten stap voor eiwitsynthese en vertegenwoordigt een belangrijk punt op die cellen hun productie van eiwitten regelen. Verordening voor eiwitsynthese is de sleutel tot cellulaire stress-respons, en disregulatie staat centraal in veel landen van de ziekte, zoals kanker. Bijvoorbeeld, hoewel cellulaire stress tot de remming van de globale vertaling door geluidwerende GLB-afhankelijke initiatie leidt, zijn bepaalde stressrespons eiwitten selectief vertaald in een GLB-onafhankelijke manier. Discrete RNA regelgevende elementen, zoals cellulaire interne ribosome entry sites (IRESes), toestaan voor de vertaling van deze specifieke mRNAs. Identificatie van dergelijke mRNAs, en de karakterisatie van hun regulerende mechanismen, zijn een belangrijk gebied in de moleculaire biologie. Toeprinting is een methode voor de studie van RNA structuur en functie als het gaat om de initiatie van de vertaling. Het doel van toeprinting is om te beoordelen van het vermogen van in vitro Getranscribeerd RNA tot stabiele complexen met ribosomen onder uiteenlopende omstandigheden, om te bepalen welke sequenties, structurele elementen of bijkomende factoren zijn betrokken bij ribosoom bindende — een pre-cursor voor efficiënte vertaling initiatie. Naast andere technieken, zoals de analyse van de westerse en Polysoom profielen, zorgt toeprinting voor een robuuste karakterisering van mechanismen voor de regulering van de inleiding van de vertaling.
Introduction
Als vertaling meest cellulaire energie verbruikt, is het zinvol dat de vertaling strak gereguleerde1 is. Omgekeerd, disregulatie van de vertaling- en de daaruit voortvloeiende wijzigingen in de uitvoer van de eiwit-wordt vaak waargenomen in stress-respons en ziekte, zoals kanker1,2. Een groot voordeel van translationeel controle is de snelheid waarmee cellen hun productie van eiwitten veranderen kunnen om te reageren op verschillende stimuli3. Vertaling verordening vormt aldus een belangrijk mechanisme die invloed op de overleving van de cel en dood1,2,3 hebben kan. Van de stappen van de vertaling is Inleiding de meeste zeer gereglementeerde en complexe3. Kort, meest eukaryotische mRNAs bevatten een 5′ m7G GLB dat bijna altijd essentieel is voor de vertaling ervan. Aanvang van de GLB-afhankelijke vereist eukaryotische initiatie factoren eIF4E, eIF4A en eIF4G (de GLB-erkenning complex) om te interageren met het 5′ einde van de mRNA. Het 43S preinitiation ribosoom complex, waarin eIF2-gebonden initiator tRNA en eIF3, is aangeworven aan het einde 5′ van de mRNA via een interactie tussen eIF4G en eIF3. De complexe preinitiation wordt beschouwd als het scannen van mRNA, geholpen door de eIF4A (een RNA helicase) totdat de start codon (AUG) ligt. De 48S Inleiding complexe vervolgens wordt gevormd en tRNA wordt geleverd in de P-site van het ribosoom. Tot slot zijn de 60S en 40S ribosoom subeenheden Verenigd om te vormen van de complexe, 80S-inleiding gevolgd door vertaling rek1,3,4. In tegenstelling, omzeilen interne ribosome entry sites (IRESes) de eis voor een 5′-cap door de indienstneming van de subeenheid 40S ribosomal rechtstreeks naar de inleiding codon3. Fysiologische stress voorwaarden verzachten globale vertaling van mRNA als gevolg van wijzigingen van belangrijke algemene eukaryotische initiatie factoren (eIFs). Echter niet-canonieke vertaling initiatie mechanismen kunnen voor selectieve vertaling van bepaalde mRNAs die vaak stressrespons eiwitten coderen en disregulatie van niet-canonieke vertaling inleiding is betrokken bij ziekte staten zoals kanker 1 , 2. discrete RNA regelgevende elementen, zoals cellulaire IRESes, toestaan voor de vertaling van dergelijke mRNAs2,3.
Een bijzonder interessant aspect van translationeel controle is te begrijpen van de mechanismen van canonieke versus niet-canonieke vertaling van een bepaalde mRNA. Toeprinting is een techniek waarmee de mechanistische detailstudie van vertaling inleiding van specifieke RNAs in vitro. Het algemene doel van toeprinting is om te beoordelen van het vermogen van een RNA van belang om de vorming van een complex met het ribosoom onder uiteenlopende omstandigheden, vertaling-initiatie ervoor om te bepalen welke sequenties, structurele elementen of accessoire factoren zijn vereist voor het initiëren van de efficiënte vertaling. Bijvoorbeeld, misschien ribosoom werving worden belemmerd in het ontbreken van een 5′-cap maar gestimuleerd door de aanwezigheid van een IRES.
Het principe van de techniek is in vitro transcriberen een RNA van belang, het broeden in de aanwezigheid van cellulaire extracten met vertaling onderdelen (of de gezuiverde componenten) zodat de inleiding complexen te vormen en om te keren transcriberen het RNA met een specifieke primer. Stabiele complexen van RNA-ribosoom zal leiden tot omgekeerde transcriptie tot stilstand op de 3′-rand van het ribosoom-de zogenaamde ‘toeprint’5,6,7.
In dit protocol, de ribosomal subeenheden, eIFs, tRNAs en IRES trans-acteren factoren (ITAFs) zijn gunstig bijgedragen door konijn Retikulocyt lysate (RRL). Een ander voordeel van dit protocol is het gebruik van een primer fluorescently-label en fluorescentie gel gebaseerde imager, in plaats van een radiolabeled primer. Dit elimineert de extra stappen, met inbegrip van radiolabeling van de primer, evenals de gel drogen en blootstelling aan een toenemende scherm. De fluorescerende bands van gasten worden geregistreerd in real time als de gel loopt, waardoor voor grotere resolutie. Afgetopte X-gebonden remmer van apoptosis eiwit (XIAP) IRES RNA wordt gebruikt als een voorbeeld hier, hoewel afgetopte mRNAs kan ook door deze techniek8worden geanalyseerd.
In tegenstelling tot westerse analyse, die de uiteindelijke uitvoer van het vertaalproces in cel lysates meet, is toeprinting een in vitro -benadering voor het meten van de vertaling initiatie complexvorming op een RNA. Deze reductionistische aanpak zorgt voor de zeer gedetailleerde studie van substraten of factoren die vertaling initiatie regelen (bv., afgetopte of un-afgetopte mRNA, IRES structuur, aan- of afwezigheid van poly-A-staart, bepaling van specifieke proteïne factoren, enz.). Vandaar, toeprinting kunnen worden gebruikt om te bestuderen van de verschillende wijzen van vertaling8 of de effecten van mRNA structuren, zoals IRESes, op eiwit synthese9,10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Toeprinting is een krachtige techniek om direct het vermogen meten van een RNA van belang ter ondersteuning van de vorming van vertaling initiatie complexen onder zeer gecontroleerde omstandigheden. Dit protocol beschrijft een vereenvoudigde methode voor toeprinting zoogdieren RNAs. Konijn Retikulocyt lysate (RRL) wordt gebruikt als een handige bron van ribosomen, eIFs, initiator tRNA en IRES trans-handelend factoren (ITAFs). De experimentator biedt hun RNA van keuze en kan ook het aanvullen van de reactie van d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door een natuurwetenschappen, Engineering Raad van Canada-Discovery onderzoeksbeurs (RGPIN-2017-05463) en de Stichting van Canada voor innovatie-John R. Evans leiders Fonds (35017), de Campus Alberta innoveert programma en de Alberta-ministerie van Economische ontwikkeling en handel.
Materials
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sucrose, molecular biology grade | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| 500mL bottle top filtration units, 0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamide | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (disodium salt, dihydrate) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| Xylene cyanol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 transcription kit | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit | Ambion | AM1344 | |
| Acid Phenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. | Green Hectares, USA | Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Mix equal parts for a stock of 25 mM each. |
| AMV-RT, 10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA analyzer | LI-COR | Product has been discontinued | |
| APS (Ammonium Persulfate) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
Referências
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).
- Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression. J Nucleic Acids. 2016, 8235121 (2016).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).
- Anthony, D. D., Merrick, W. C. Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition. J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).
- Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).
- Shirokikh, N. E., et al. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Res. 38 (3), 15 (2010).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Thakor, N., et al. Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation. RNA Biol. , 1-15 (2016).
- Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP. Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).
- Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).
- Merrick, W. C. Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes. J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).
- Arnaud, E., et al. A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor. Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).
- Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. J Vis Exp. (92), e52295 (2014).
- Duncan, C. D. S., Mata, J. Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe. Sci Rep. 7 (1), 10331 (2017).
- Beck, H. J., Janssen, G. R. Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5′-Terminal AUG. J Bacteriol. 199 (14), (2017).
