Murino salivar avaliação funcional através de pilocarpina estimulação seguinte fracionada de radiação
Summary
Apresentamos uma abordagem detalhada para realizar coleta de saliva, incluindo murino traqueostomia e o isolamento dos três glândulas salivares maiores.
Abstract
Hipossalivação é comumente observada na reação auto-imune da síndrome de Sjögren ou seguir lesão de radiação para as glândulas salivares maiores. Nestes casos, perguntas permanecem sobre a patogênese da doença e de intervenções eficazes. A técnica otimizada que permite a avaliação funcional das glândulas salivares é inestimável para investigação terapêutica, disfunção e biologia de glândula exócrina. Aqui, apresentamos uma abordagem passo a passo para executar pilocarpina estimulou a secreção de saliva, incluindo a traqueostomia e a dissecação das três principais murino glândulas salivares. Também detalhamos a anatomia cabeça e pescoço murino apropriada acessada durante estas técnicas. Esta abordagem é escalável, permitindo vários mouses para serem processados simultaneamente, melhorando assim a eficiência do fluxo de trabalho. Nosso objetivo é melhorar a reprodutibilidade destes métodos, cada qual tem mais aplicativos dentro do campo. Além da recolha de saliva, discutimos métricas para quantificar e normalizando a capacidade funcional desses tecidos. Dados representativos são incluídos a partir de glândulas submandibulares com função deprimida glândula salivar 2 semanas seguintes à radiação fracionada (4 doses de 6.85 Gy).
Introduction
Distúrbios da glândula salivar incluem síndromes de desregulação ou secreção prejudicada, levando a subprodução (xerostomia e hipossalivação) de saliva1ou superprodução (sialorrhea). Em ambos os casos, há interesse em melhorar a nossa compreensão da biologia da glândula salivar com o objectivo final de desenvolvimento terapêutico2.
As glândulas salivares são órgãos altamente radiosensitive e muitas vezes são danificadas durante a radioterapia de câncer de cabeça e pescoço, levando a permanente boca seca (xerostomia)3,4. Ao contrário de outros tecidos radiosensitive, no entanto, a taxa de rotatividade das glândulas salivares é relativamente baixa, e o mecanismo de perda secretora é mal compreendido5,6. Neste cenário de lesão única, estratégias de regeneração e protecção contra as radiações de tecido requerem avaliação funcional salivar. Experimentalmente, coleta de saliva murino é uma ferramenta particularmente valiosa em avaliar a resposta de glândula a radiação e agentes terapêuticos.
Aqui, apresentamos um método para executar e quantificar a secreção de saliva estimulada usando pilocarpine, um potente agonista muscarínico7. Pilocarpina estimula o sistema nervoso autônomo para induzir a secreção de glândula8,9. Para completar este teste apropriadamente, uma traqueostomia é necessária para garantir que o rato mantém uma via aérea patente durante todo o procedimento e para reduzir os riscos de asfixia e aspiração de secreções em pool na cavidade oral10.
Este é um procedimento terminal, culminando na remoção de uma das três principais glândulas salivares: as parótidas (PG), a submandibular (SMG) e a sublingual (SLG). Para estudos funcionais, glândula pesos são registados e são frequentemente usados para normalizar a saliva medição11,12,13. Este dados são particularmente importantes em estudos de radiação, em que a atrofia da glândula é um resultado esperado14,15
Há variabilidade na literatura em relação à secreção de saliva como estimulada é executada e relatou16. Por exemplo, doses de pilocarpina dentro da literatura extensão pelo menos três ordens de magnitude17,18,19,20,21,22,23. Aqui, apresentamos um protocolo de pilocarpina otimizada de alta dose com a intenção de melhor reprodutibilidade na execução do método, bem como fornecendo uma plataforma modular de técnicas (traqueostomia, coleta de saliva e dissecação de glândula) que pode ser adaptado como precisava.
Além de demonstração de protocolo, incluímos dados funcionais representativos do fluxo de saliva em 2 semanas seguintes à radiação fracionada (4 doses de Gy 6.85) para a região SMG.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apresentamos um método várias etapas para avaliar a função de glândula salivar, que pode ser aplicada para estudar terapêutica e lesão da glândula. Nosso procedimento envolve a traqueostomia, coleta de saliva e dissecação de glândula, cada qual com aplicações experimentais que podem suportar um estudo integrado da biologia de glândula salivar. Por exemplo, traqueostomia murino tem sido usada para gestão geral das vias respiratórias durante os procedimentos de obstruir a cavidade oral.
<p class="jove_c…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de dentária e Craniofacial Research (NIDCR) e o National Cancer Institute (NCI) do institutos nacionais da saúde sob prêmio número R56 DE025098, DE027695 UG3 e CA206296 F30. O conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representa necessariamente a opinião oficial do institutos nacionais da saúde. Este trabalho também foi apoiado pela NSF DMR 1206219 e a inovação IADR no prêmio de cuidado Oral (2016).
Gostaríamos de agradecer o Dr. Eri Maruyama e Andrew Hollomon por sua ajuda com a coleta de saliva. Gostaríamos de agradecer sua assistência com dissecação de glândula Pei-Lun Weng. Gostaríamos de agradecer a Matthew Ingalls por sua assistência na preparação de figura. Gostaríamos de agradecer o Dr. Elaine Smolock e Emily Wu para leitura crítica deste manuscrito.
Materials
| Pilocarpine hydrochloride | Sigma Aldrich | P6503 | Pilocarpine |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91500-9 | Spring Scissors for Tracheostomy |
| Sterile Saline Solution | Medline | RDI30296H | Saline |
| Dumont #7 Forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | Curved Forceps |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | Straight Forceps |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | Blunt Forceps |
| Fine Scissors- Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Dissection Scissors |
| Microhematocrit Heparinized Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22362566 | Capillary tubes |
| Lubricant Eye Ointment | Refresh | N/A | Refresh Lacri-Lube |
| Goat polyclonal anti-Nkcc1 | Santa Cruz Biotech | SC-21545 | Nkcc1 Antibody |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | DAPI |
| GraphPad Prism | GraphPad | ver6.0 | Statistical Software |
| Cotton tipped applicator | Medline | MDS202000 | Applicator for eye ointment |
| 0.5cc Insulin Syringe, 29G x 1/2" | BD | 7629 | Syringe for intraperitoneal injection |
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