JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociência

Ex Utero Electroporation en Organotypic Slice culturen van muis embryonale hersenen voor Live-Imaging van GABAergic interneuronen migreren

Published: April 20, 2018
doi:
10.3791/57526
, , ,
1Centre de recherche du CHU Sainte-Justine, 2Department of Neuroscience,Université de Montréal, 3Department of pathology and cellular biology,Université de Montréal, 4Department of Pediatrics,Université de Montréal

Summary

Hier bieden we een goedkope en betrouwbare methode voor het genereren van electroporated brein organotypic segment culturen van muis embryo’s geschikt voor confocale microscopie en live-imaging technieken.

Abstract

GABAergic interneuronen (INs) zijn kritieke onderdelen van neuronale netwerken dat station cognitie en gedrag. INs bestemd voor het vullen van de cortex tangentieel migreren van hun plaats van herkomst in het ventrale telencephalon (met inbegrip van de mediale en caudal ganglionaire eminenties (MGE, CGE)) naar de dorsale corticale plaat in reactie op een verscheidenheid van intrinsieke en extrinsieke signalen. Verschillende methoden zijn ontwikkeld de afgelopen jaren genetisch manipuleren van specifieke studierichtingen en onderzoeken hoe zij de dynamische cytoskeletal veranderingen die nodig zijn voor goede werking regelen IN migratie. In utero electroporation is uitgebreid gebruikt voor het bestuderen van het effect van gene onderdrukking of overexpressie in specifieke IN subtypen terwijl het beoordelen van de effecten op de morfologie en definitief standpunt. Echter, terwijl deze aanpak gemakkelijk gebruikt wordt voor radiaal migreren piramidale cellen wijzigen, het is meer technisch uitdagende wanneer gericht op INs. In utero electroporation een lage opbrengst gegeven de verminderde overlevingscijfers van pups genereert wanneer Electroporation geschiedt vóór e14.5, zoals gebruikelijk is bij de studie van INs MGE-afgeleide. In een alternatieve benadering, MGE explantaten bieden gemakkelijk toegang tot de MGE en vergemakkelijken van de beeldvorming van genetisch gemodificeerde INs. Echter, in deze explantaten, INs migreren naar een kunstmatige matrix, verstoken van endogene begeleiding signalen en de thalamus ingangen. Dit leidde ons te optimaliseren van een methode waar INs in een meer natuurlijke omgeving, migreren kunt terwijl het omzeilen van de technische uitdagingen van in utero benaderingen. In dit artikel beschrijven we de combinatie van ex utero electroporation van muis embryonale hersenen gevolgd door organotypic segment culturen gemakkelijk bijhouden, afbeelding en reconstrueren van genetisch gemodificeerde INs migreren over hun natuurlijke paden in reactie op endogene signalen. Deze aanpak maakt het mogelijk voor zowel de kwantificering van de dynamische aspecten van migratie met time-lapse confocal beeldvorming, evenals de gedetailleerde analyse van verschillende morfologische parameters met behulp van neuronale reconstructies op vaste immunolabeled weefsel.

Introduction

Corticale GABAergic interneuronen (INs) zijn divers met betrekking tot hun eigenschappen van biochemische, fysiologische eigenschappen en connectiviteit, en bemiddelen zij verschillende functies in volwassen netwerken1,2,3 ,4,5. De specificatie van verschillende subtypen van corticale INs is strak geregeld door middel van genetische cascades die uitgebreid bestudeerde1,2 zijn. Het merendeel (70%) van corticale GABAergic INs zijn afkomstig uit de vermelding in de mediale ganglionaire eminentie (MGE), een ventrally gelegen embryonale structuur, en moet migreren over relatief lange afstanden te bereiken van de corticale plaat1, 2 , 6. terwijl de corticale piramidale cellen migreren radiaal van de ventriculaire zone (VZ) naar de corticale plaat langs de radiale glia steiger, de tangentiële migratie van INs, die zijn niet gekoppeld aan een dergelijke steiger, vereist een verscheidenheid van intrinsieke en Extrinsieke signalen te trekken migreren neuronen richting de corticale plaat, terwijl begeleiden hen uit de buurt van niet-corticale structuren2,7,8. Na het verlaten van de celcyclus, INs zijn afgestoten uit de MGE door middel van chemo-afstotend signalen uitgedrukt binnen de VZ van de MGE, die triggers van tangentiële migratie naar de corticale plaat9,10. Migreren van INs voorkomen het striatum met behulp van verschillende afstotend aanwijzingen11 en, na het bereiken van de corticale plaat, ze overschakelen van een tangentiële naar een radiale migratiemodus en bereiken hun definitieve laminaire standpunt, mede in reactie op signalen van piramidale cellen12 en andere cellulaire bevolking13. De migratie van INs, wat betreft andere neuronale populaties, omvat verschillende dynamische morfologische veranderingen zodat de werkelijke beweging van het neuron. Deze zogenaamde neuronale motoriek wordt gekenmerkt door herhaalde cycli van drie opeenvolgende stappen: de rek van een toonaangevende proces, een actieve anterograde motie van de kern (nucleokinesis), en de intrekking van de afsluitende proces14. Migratie is gereglementeerd door talrijke intrinsieke en extrinsieke signalen dat station de vertakking en actieve verbouwing van het toonaangevende proces begeleiden INs in de juiste richting, bepalen van zowel de richting en de snelheid van migratie14,15 ,16.

De regulering van de corticale migratie determinanten zijn uitvoerig bestudeerd in de afgelopen jaren1,2,7,17,18,19,20, en ontwrichting in sommige van deze moleculaire actoren heeft geweest gepostuleerd leiden tot neurologische aandoeningen, zoals pediatrische Refractaire Epilepsie of autisme spectrum stoornissen1,2,21, 22 , 23 , 24. daarom de ontwikkeling van verschillende benaderingen van in vitro pt in vivo heeft uitgeoefend om ons vermogen om te studeren dit dynamisch proces, als eerder gerecenseerd25aanzienlijk verder te gaan. In vitro methoden, met inbegrip van de bepaling van Boyden kamer en de Stripe keuze Assay, bieden de snelste en meest reproduceerbare middelen voor de beoordeling van de eis en de cel-autonome impact van specifieke genen of eiwitten tijdens de neuronale migratie zonder de invloed van andere factoren-25. Deze testen zijn met name handig wanneer gecombineerd met live-imaging8,26,27. Met deze technieken, INs gemakkelijk kunnen worden opgehaald van e13.5 MGE en geïsoleerd door enzymatische en mechanische dissociatie, waarna verschillende signaalroutes en begeleiding signalen kunnen worden onderzocht, zoals eerder geïllustreerd8,28 . Echter, deze tests vinden plaats in een kunstmatige extracellulaire matrix in de afwezigheid van drie-dimensionale weefsel architectuur, die van neuronale gedrag en cel eigenschappen veranderen kan, potentieel op het gebied van migratie en/of overleving van de cel25. Om te omzeilen deze beperkingen, zijn ex vivo MGE explantaten ontwikkeld als een alternatieve instrument te kwantificeren van de dynamische morfologische veranderingen die zich voordoen tijdens de migratie samen met parameters zoals snelheid en oriëntatie14, 29. Genereren van MGE explantaten is betrekkelijk eenvoudig en uitgebreid is geweest30elders beschreven. Goed bestuur houdt de beplating van een klein uittreksel van de MGE op een monolayer van gemengde corticale cellen of in een mengsel van matrigel en collageen in de aanwezigheid van aantrekkelijke of weerzinwekkend signalen25, hoewel de laatste optionele31 zijn. MGE explantaten toestaan voor hoge resolutie imaging van dunbevolkte gelabelde cellen, vereenvoudiging van de studie van intracellulaire processen, zoals het cytoskeletal remodelleren toonaangevende tijdens vertakking, zoals eerder32,33 ,34 en in de huidige studie. MGE explantaten hebben met succes gebruikt om te beoordelen van dynamische cytoskeletal veranderingen tijdens de migratie in een 2D omgeving, bijvoorbeeld na specifieke farmacologische of Chemotactische manipulaties (zie bijvoorbeeld Tielens et al. 201633) . Echter, met deze benadering, INs migreren binnen een kunstmatige matrix, en dit kan worden gewijzigd IN het gedrag en de reproduceerbaarheid en de betekenis van de experimentele resultaten.

Daarentegen, in utero electroporation kan de genetische manipulatie van INs in hun eigen omgeving en is een veel gebruikte methode om snel en efficiënt beoordelen de impact van winst en verlies van de genfunctie tijdens het omzeilen van de beperkingen van kostbare en tijdrovende knock-out en knock-in strategieën25,35. In utero electroporation kan een vertekend beeld geven richting IN de progenitoren met behulp van cel type specifieke initiatiefnemers en door positionering van de elektroden naar ventromediale structuren, met inbegrip van de MGE36. Bovendien, in utero electroporation zorgt voor de tijdige uitdrukking van experimentele constructies binnen 1-2 dagen, in vergelijking met de 7-10 dagen nodig voor construct expressie met behulp van virale vectoren25. Echter, in utero electroporation van IN progenitoren neigt te zijn van lage-opbrengst. Inderdaad, hoewel piramidale cel progenitoren gelegen in de dorsale ventriculaire zone kunnen efficiënt zijn transfected gebruiken in utero electroporation, gericht op meer ventrally gelegen structuren, zoals de MGE, is meer technisch uitdagende, vooral in kleine e13.5 vermindert embryo’s en het hoge tempo van embryonale letaliteit verder de experimentele opbrengst25.

Te omzeilen enkele technische beperkingen in vitro gekoppeld MGE explant experimenten en in vivo in utero electroporation, ex vivo organotypic segment culturen geweest ontwikkelde8,37, 38,39. Hersenen organotypic segment culturen bieden het voordeel van het nabootsen van in vivo voorwaarden, terwijl het minder dure en tijdrovende dan genereren25 diermodellen. Inderdaad, deze preparaten toestaan een gemakkelijke toegang tot de MGE, samen met de specifieke visualisatie van INs, en kunnen worden gecombineerd met focal electroporation te onderzoeken van specifieke moleculaire pathways in INs migreren in een meer fysiologische omgeving8 , 39 , 40 , 41. Wij hebben daarom een aanpak voor organotypic culturen38, waarin we gecombineerd met ex utero electroporation en time-lapse confocal imaging geoptimaliseerd, verdere beoordeling van de morfologische en dynamische proces optreedt tijdens de tangentiële migratie van MGE-INs. Dit protocol werd aangepast en geoptimaliseerd van anderen die hebben gebruikt ex utero of in utero hersenen electroporation en organotypic segment culturen bij het bestuderen van de migratie van piramidale cellen42,43 en corticale INs36,39,44. In het bijzonder muis embryo’s zijn onthoofd en de MGE is electroporated ex vivo na de intraventricular injectie van de experimentele plasmiden, waardoor meer efficiënte en nauwkeurige targeting van MGE voorlopercellen dan wat kan worden bereikt met in utero electroporation. De hersenen worden vervolgens uitgepakt en gesegmenteerd in hele hersenen coronale plakjes die kunnen worden gekweekt voor een paar dagen, waardoor continu bijhouden en beeldvorming van transfected INs. Deze aanpak meestal etiketten het tangentieel migreren INs 5-20 per segment van de hersenen, het minimaliseren van het aantal experimentele iteraties verplicht te bereiken van statistische significantie, terwijl het labelen van een voldoende neuronale bevolkingsdichtheid zodat eenvoudige scheiding van Individuele neuronen voor wederopbouw en fijne morfologische beoordeling. Bovendien, in vergelijking met MGE explantaten, organotypic culturen zorgen dat migreren INs worden blootgesteld aan een meer natuurlijke omgeving, met inbegrip van lokaal secreted chemokines en inbreng van de thalamus afferents. Deze aanpak is dus zeer geschikt voor het kwantificeren van de directionaliteit en trekkende pad goedkeuring door transfected INs, terwijl het aanbieden van voldoende anatomisch gedetailleerde informatie over de karakterisatie van fijnere dynamische processen zoals het leidende proces vertakking, zodat nucleokinesis en afsluitende proces intrekking.

Protocol

Alle experimenten met dieren werden goedgekeurd door het Comité Institutionnel des Bonnes Pratiques avec les Animaux de Recherche (CIBPAR) in het CHU Sainte-Justine Research Center en werden uitgevoerd volgens de Canadese Raad op Animal Care guide de zorg en het gebruik van proefdieren (Ed. 2). Het protocol hier beschreven is geoptimaliseerd voor electroporation van embryo’s ten embryonale dage (e) 13,5, op een moment wanneer MGE afkomstige INs zijn actief gegenereerd, voordat de piek van CGE…

Representative Results

In deze sectie bieden wij representatieve resultaten verkregen na de ex utero electroporation van een controle-plasmide of een experimentele plasmide gericht op een gen van belang, in de MGE van e13.5 muis embryo’s gevolgd door organotypic segment culturen geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 48 uur (voor time-lapse imaging) of 72 h (voor fixatie en labelen van immunohistochemical) (Zie figuur 1B voor schematisch protocol). Representatieve voorbeelden …

Discussion

In dit artikel bieden wij een betrouwbare methode voor het uitvoeren van ex utero electroporation van de muis MGE op e13.5 en voor de generatie van organotypic culturen van embryonale hersenen segmenten. Hoewel in vitro methoden, zoals de Boyden kamer Assay, zijn relatief gemakkelijk uit te voeren en kunnen worden gebruikt voor het beoordelen van de specifieke rol van verschillende genen en eiwitten zonder tussenkomst van andere factoren, zij het onderzoek van de IN de weg dat migratie dynamiek met betr…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door de exploitatiesubsidies van de Savoy-Stichting en de Stichting CURE epilepsie en door apparatuur verleent van de Canadese Stichting voor innovatie E.R (confocal microscoop) en G.H (draaiende schijf confocal microscoop). E.R. ontvangt een carrière award van de Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S; Clinician-Scientist Award) en uit de Canadese instituten voor gezondheidsonderzoek (CIHR; Young Investigator Award). G.H. is een senior geleerde van de FRQ-S. Le is de ontvanger van de Steriade-Savoy postdoctorale opleiding award van de Savoy Foundation, de CHU Sainte-Justine Stichting postdoctorale opleiding award en de FRQ-S postdoctorale opleiding award, in samenwerking met de Stichting van de sterren. Dit project is mogelijk gemaakt door hersenen Canada via het Canada hersenen onderzoeksfonds, met de financiële steun van Health Canada, toegekend aan L.E.

Materials

Neurobasal Medium ThermoFisher Scientific 21103049 Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html
B-27 serum-free supplement ThermoFisher Scientific 17504044 50X Serum-free neuron specific supplement
15 mL sterile centrifuge tubes Sarstedt 62.554.002
Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine) ThermoFisher Scientific 11415064 Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor's website 
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
Horse serum, heat inactivated Millipore-Sigma H1138-500ML
Neurocell supplement N-2 100X Wisent 305-016 Botteinstein's N-2 Formulation
VWR Square PETG Media Bottles 125 mL VWR 89132-062
Class II Type A Biosafety Cabinet Nuaire NU-540
Sucrose BioShop SUC700.1
Sodium Chloride BioShop SOD001.1
Sodium bicarbonate ThermoFisher Scientific S233-500
D+ glucose Millipore-Sigma G7528-250G
Potassium Chloride ThermoFisher Scientific P217-500
Sodium phosphate monobasic anhydrous BioShop SPM400.500
Calcium chloride dihydrate  ThermoFisher Scientific C79-500
Magnesium sulfate heptahydrate BiosShop MAG522
Agarose BioShop AGA002.500
50 mL sterile centrifuge tubes Sarstedt 62.547.004
1.5 mL centrifuge tubes Sarstedt 72.690.001
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Model P-97
0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube Drummond scientific 1-000-800/12
Ethanol VWR E193
5 mL syringe Becton Dickinson & Co 309646
Mineral Oil (heavy) Rougier Pharma
WPI Swiss Tweezers #5 World Precision Instruments 504511 11 cm, straight, 0.06×0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these.
WPI Swiss Tweezers #7 World Precision Instruments 504504 11.5 cm, 0.18×0.2mm, curved tips
HTC Tweezers World Precision Instruments 504617 11 cm, Straight, flat
Operating scissors World Precision Instruments 501225 16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these.
Dressing Forceps World Precision Instruments 501217 12.5 cm, straight, serrated
Iris Forceps World Precision Instruments 504478 10.2 cm, full curve, serrated
DeBakey Tissue Forceps World Precision Instruments 501996 15 cm, 45° angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide
Fisherbran Microspatula with rounded ends FisherScientific 21-401-5 You will need 2 of these.
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector Drummond scientific 3-000-204
TC Dish 60, Standard Sarstedt 83.3901 60-mm dish
Tissue culture dish Sarstedt 83.1800 35-mm dish
Black Wax FisherScientific S17432
Transfer pipettes  Ultident 170-CTB700-212 3 mL, small bulb
Stereo Microscope Leica Biosystems Leica M80 In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific)
Electro Square Porator BTX Harvard Apparatus ECM 830
Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm BTX Harvard Apparatus 45-0487
25G 1 1/2 Becton Dickinson & Co 305127
Leica VT1000S Vibrating blade microtome Leica Biosystems VT1000S
GEM, Single edge razor blade Electron Microscopy Sciences 71952-10 Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome
µ-Slide 8 well Ibidi 80827 Pack of 15
Millicell cell culture insert Millipore-Sigma PICM0RG50 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore, pack of 50. 
Leica DMi6000 microscope Leica Microsystems N/A
Spinning disk confocal head Ultraview Vox Perkin Elmer N/A
Volocity 6.0 acquisition software Improvision/Perkin Elmer N/A
LiveCell Stage top incubation system Pathology devices LC30030 Provides Temperature, CO2 and humidity control. 
SP8 confocal microscope Leica
mCherry-Lifeact-7 Addgene 54491 Gift from Michael Davidson
Fast Green FCF Millipore-Sigma F7258-25G 25G bottle, certified by the Biological Stain Commission
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Rossignol, E. Genetics and function of neocortical GABAergic interneurons in neurodevelopmental disorders. Neural Plast. , 649325 (2011).
  2. Jiang, X., Lachance, M., Rossignol, E. Involvement of cortical fast-spiking parvalbumin-positive basket cells in epilepsy. Prog Brain Res. 226, 81-126 (2016).
  3. Ascoli, G. A., et al. Petilla terminology: nomenclature of features of GABAergic interneurons of the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 9, 557-568 (2008).
  4. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321, 53-57 (2008).
  5. Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J Physiol. 562 (Pt 1), 9-26 (2005).
  6. Rudy, B., Fishell, G., Lee, S., Hjerling-Leffler, J. Three groups of interneurons account for nearly 100% of neocortical GABAergic neurons. Dev Neurobiol. 71 (1), 45-61 (2011).
  7. Marin, O. Cellular and molecular mechanisms controlling the migration of neocortical interneurons. Eur J Neurosci. 38 (1), 2019-2029 (2013).
  8. Flames, N., et al. Short- and long-range attraction of cortical GABAergic interneurons by neuregulin-1. Neuron. 44 (2), 251-261 (2004).
  9. Zhu, Y., Li, H. -. S., Zhou, L., Wu, J. Y., Rao, Y. Cellular and molecular guidance of GABAergic neuronal migration from an extracortical origin to the neocortex. Neuron. 23, 473-485 (1999).
  10. Zimmer, G., et al. Ephrin-A5 acts as a repulsive cue for migrating cortical interneurons. Eur J Neurosci. 28 (1), 62-73 (2008).
  11. Nobrega-Pereira, S., et al. Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors. Neuron. 59 (5), 733-745 (2008).
  12. Lodato, S., et al. Excitatory projection neuron subtypes control the distribution of local inhibitory interneurons in the cerebral cortex. Neuron. 69 (4), 763-779 (2011).
  13. Elias, L. A., Turmaine, M., Parnavelas, J. G., Kriegstein, A. R. Connexin 43 mediates the tangential to radial migratory switch in ventrally derived cortical interneurons. J Neurosci. 30 (20), 7072-7077 (2010).
  14. Bellion, A., Baudoin, J. P., Alvarez, C., Bornens, M., Metin, C. Nucleokinesis in tangentially migrating neurons comprises two alternating phases: Forward migration of the Golgi/centrosome associated with centrosome splitting and myosin contraction at the rear. J Neurosci. 25 (24), 5691-5699 (2005).
  15. Marin, O., Valiente, M., Ge, X., Tsai, L. H. Guiding neuronal cell migrations. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (2), a001834 (2010).
  16. Martini, F. J., Valdeolmillos, M. Actomyosin contraction at the cell rear drives nuclear translocation in migrating cortical interneurons. J Neurosci. 30 (25), 8660-8670 (2010).
  17. Wamsley, B., Fishell, G. Genetic and activity-dependent mechanisms underlying interneuron diversity. Nat Rev Neurosci. , (2017).
  18. Chu, J., Anderson, S. A. Development of cortical interneurons. Neuropsychopharmacology. 40 (1), 16-23 (2015).
  19. Metin, C., Baudoin, J. P., Rakic, S., Parnavelas, J. G. Cell and molecular mechanisms involved in the migration of cortical interneurons. Eur J Neurosci. 23 (4), 894-900 (2006).
  20. Hernandez-Miranda, L. R., Parnavelas, J. G., Chiara, F. Molecules and mechanisms involved in the generation and migration of cortical interneurons. ASN Neuro. 2 (2), e00031 (2010).
  21. Batista-Brito, R., et al. The cell-intrinsic requirement of Sox6 for cortical interneuron development. Neuron. 63 (4), 466-481 (2009).
  22. Marcorelles, P., et al. Evidence for tangential migration disturbances in human lissencephaly resulting from a defect in LIS1, DCX and ARX genes. Acta Neuropathol. 120 (4), 503-535 (2010).
  23. McManus, M. F., Nasrallah, I. M., Pancoast, M. M., Wynshaw-Boris, A., Golden, J. A. Lis1 is necessary for normal non-radial migration of inhibitory interneurons. Am J Pathol. 165 (3), 775-784 (2004).
  24. Pancoast, M., Dobyns, W., Golden, J. A. Interneuron deficits in patients with the Miller-Dieker syndrome. Acta Neuropathol. 109 (4), 400-404 (2005).
  25. Azzarelli, R., Oleari, R., Lettieri, A., Andre, V., Cariboni, A. In Vitro, Ex Vivo and In Vivo Techniques to Study Neuronal Migration in the Developing Cerebral Cortex. Brain Sci. 7 (5), (2017).
  26. Wang, Z. Z., et al. Chemokine-like factor 1 promotes the migration of rat primary cortical neurons by the induction of actin polymerization. Neuroreport. 25 (15), 1221-1226 (2014).
  27. Zito, A., et al. Neuritin 1 promotes neuronal migration. Brain Structure and Function. 219 (1), 105-118 (2014).
  28. Rakic, S., et al. Cdk5 phosphorylation of ErbB4 is required for tangential migration of cortical interneurons. Cereb Cortex. 25 (4), 991-1003 (2015).
  29. van den Berghe, V., et al. Directed migration of cortical interneurons depends on the cell-autonomous action of Sip1. Neuron. 77 (1), 70-82 (2013).
  30. Nery, F. C., et al. New methods for investigation of neuronal migration in embryonic brain explants. J Neurosci Methods. 239, 80-84 (2015).
  31. Vidaki, M., et al. Rac1-dependent cell cycle exit of MGE precursors and GABAergic interneuron migration to the cortex. Cereb Cortex. 22 (3), 680-692 (2012).
  32. Lysko, D. E., Putt, M., Golden, J. A. SDF1 reduces interneuron leading process branching through dual regulation of actin and microtubules. J Neurosci. 34 (14), 4941-4962 (2014).
  33. Tielens, S., et al. Elongator controls cortical interneuron migration by regulating actomyosin dynamics. Cell Res. 26 (10), 1131-1148 (2016).
  34. Shinohara, R., et al. A role for mDia, a Rho-regulated actin nucleator, in tangential migration of interneuron precursors. Nat Neurosci. 15 (3), 373-380 (2012).
  35. LoTurco, J., Manent, J. B., Sidiqi, F. New and improved tools for in utero electroporation studies of developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 19, i120-i125 (2009).
  36. De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518 (2014).
  37. Tobet, S. A., Hanna, I. K., Schwarting, G. A. Migration of neurons containing gonadotropin releasing hormone (GnRH) in slices from embryonic nasal compartment and forebrain. Dev Brain Res. 97 (2), 287-292 (1997).
  38. Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).
  39. Steinecke, A., Gampe, C., Valkova, C., Kaether, C., Bolz, J. Disrupted-in-Schizophrenia 1 (DISC1) is necessary for the correct migration of cortical interneurons. J Neurosci. 32 (2), 738-745 (2012).
  40. Friocourt, G., et al. Both doublecortin and doublecortin-like kinase play a role in cortical interneuron migration. J Neurosci. 27 (14), 3875-3883 (2007).
  41. Murthy, S., et al. Serotonin receptor 3A controls interneuron migration into the neocortex. Nat Commun. 5, 5524 (2014).
  42. Nichols, A. J., O’Dell, R. S., Powrozek, T. A., Olson, E. C. Ex utero electroporation and whole hemisphere explants: a simple experimental method for studies of early cortical development. J Vis Exp. (74), (2013).
  43. Pacary, E., Guillemot, F. Cerebral cortex electroporation to study projection neuron migration. Curr Protoc Neurosci. 77, (2016).
  44. Yozu, M., Tabata, H., Nakajima, K. The caudal migratory stream: A novel migratory stream of interneurons derived from the caudal ganglionic eminence in the developing mouse forebrain. J Neurosci. 25 (31), 7268-7277 (2005).
  45. Butt, S. J., et al. The requirement of Nkx2-1 in the temporal specification of cortical interneuron subtypes. Neuron. 59 (5), 722-732 (2008).
  46. Miyoshi, G., et al. Genetic fate mapping reveals that the caudal ganglionic eminence produces a large and diverse population of superficial cortical interneurons. J Neurosci. 30 (5), 1582-1594 (2010).
  47. Zerucha, T., et al. A highly conserved enhancer in the Dlx5/Dlx6 intergenic region is the site of cross-regulatory interactions between Dlx genes in the embryonic forebrain. J Neurosci. 20 (2), (2000).
  48. Bottenstein, J. E. . Cell culture in the neurosciences. , (1985).
  49. Wang, Y., et al. Dlx5 and Dlx6 regulate the development of parvalbumin-expressing cortical interneurons. J Neurosci. 30 (15), 5334-5345 (2010).
  50. Zheng, H., et al. Sevoflurane anesthesia in pregnant mice induces neurotoxicity in fetal and offspring mice. Anesthesiology. 118 (3), 516-526 (2013).
  51. Zhao, T., et al. Prenatal ketamine exposure causes abnormal development of prefrontal cortex in rat. Sci Rep. 6, 26865 (2016).
  52. Timpe, J. M., Wang, C. Z., Kim, J., Johnson, K. M. Alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazoleproprionic acid receptor activation protects against phencyclidine-induced caspase-3 activity by activating voltage-gated calcium channels. J Neurosci Res. 92 (12), 1785-1791 (2014).
  53. Myers, A. K., Meechan, D. W., Adney, D. R., Tucker, E. S. Cortical interneurons require Jnk1 to enter and navigate the developing cerebral cortex. J Neurosci. 34 (23), 7787-7801 (2014).
  54. Lopez-Bendito, G., et al. Chemokine signaling controls intracortical migration and final distribution of GABAergic interneurons. J Neurosci. 28 (7), 1613-1624 (2008).
  55. Close, J., et al. Satb1 is an activity-modulated transcription factor required for the terminal differentiation and connectivity of medial ganglionic eminence-derived cortical interneurons. J Neurosci. 32 (49), 17690-17705 (2012).
  56. Anderson, S. A., et al. Mutations of the homeobox genes Dlx-1 and Dlx-2 disrupt the striatal subventricular zone and differentiation of late born striatal neurons. Neuron. 19 (1), 27-37 (1997).
  57. Stuhmer, T., Anderson, S. A., Ekker, M., Rubenstein, J. L. Ectopic expression of the Dlx genes induces glutamic acid decarboxylase and Dlx expression. Development. 129 (1), 245-252 (2002).
  58. Godin, J. D., et al. p27(Kip1) is a microtubule-associated protein that promotes microtubule polymerization during neuron migration. Dev Cell. 23 (4), 729-744 (2012).
  59. Rossokhin, A. V., Sharonova, I. N., Bukanova, J. V., Kolbaev, S. N., Skrebitsky, V. G. Block of GABA(A) receptor ion channel by penicillin: Electrophysiological and modeling insights toward the mechanism. Mol Cell Neurosci. 63, 72-82 (2014).
  60. Lindquist, C. E., Dalziel, J. E., Cromer, B. A., Birnir, B. Penicillin blocks human alpha 1 beta 1 and alpha 1 beta 1 gamma 2S GABAA channels that open spontaneously. Eur J Pharmacol. 496 (1-3), 23-32 (2004).
  61. Bortone, D., Polleux, F. KCC2 expression promotes the termination of cortical interneuron migration in a voltage-sensitive calcium-dependent manner. Neuron. 62 (1), 53-71 (2009).
  62. Lin-Hendel, E. G., McManus, M. J., Wallace, D. C., Anderson, S. A., Golden, J. A. Differential mitochondrial requirements for radially and non-radially migrating cortical neurons: Implications for mitochondrial disorders. Cell Rep. 15 (2), 229-237 (2016).
  63. Lourenco, M. R., Garcez, P. P., Lent, R., Uziel, D. Temporal and spatial regulation of interneuron distribution in the developing cerebral cortex–an in vitro study. Neurociência. 201, 357-365 (2012).
  64. Mahajani, S., et al. Lamin B1 levels modulate differentiation into neurons during embryonic corticogenesis. Sci Rep. 7 (1), 4897 (2017).
  65. Liodis, P., et al. Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes. J Neurosci. 27 (12), 3078-3089 (2007).
  66. Close, J. L., et al. Single-cell profiling of an in vitro model of human interneuron development reveals temporal dynamics of cell type production and maturation. Neuron. 93 (5), 1035-1048 (2017).
  67. Chen, Y. J., et al. Single-cell RNA sequencing identifies distinct mouse medial ganglionic eminence cell types. Sci Rep. 7, 45656 (2017).
  68. Michaud, J. L., et al. The genetic landscape of infantile spasms. Hum Mol Genet. 23 (18), 4846-4858 (2014).
  69. Allen, A. S., et al. De novo mutations in epileptic encephalopathies. Nature. 501 (7466), 217-221 (2013).
  70. Bery, A., Merot, Y., Retaux, S. Genes expressed in mouse cortical progenitors are enriched in Pax, Lhx, and Sox transcription factor putative binding sites. Brain Res. 1633, 37-51 (2016).
  71. Nelson, B. R., Hodge, R. D., Bedogni, F., Hevner, R. F. Dynamic interactions between intermediate neurogenic progenitors and radial glia in embryonic mouse neocortex: potential role in Dll1-Notch signaling. J Neurosci. 33 (21), 9122-9139 (2013).
  72. Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).
  73. Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
  74. Machacek, M., et al. Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion. Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).

Tags

Ex Utero ElectroporationOrganotypic Slice CulturesEmbryonic Mouse BrainsLive-imagingMigrating GABAergic InterneuronsDevelopmental NeuroscienceGenetic Neurodevelopmental DisordersAutismEpilepsyBiosafety CabinetDissectionCultureNeural Based MediumTransfer PipetteBlack Wax
check_url/pt/57526?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Eid, L., Lachance, M., Hickson, G., Rossignol, E. Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons. J. Vis. Exp. (134), e57526, doi:10.3791/57526 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image