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Neurociência

Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen

Published: April 20, 2018
doi:
10.3791/57526
, , ,
1Centre de recherche du CHU Sainte-Justine, 2Department of Neuroscience,Université de Montréal, 3Department of pathology and cellular biology,Université de Montréal, 4Department of Pediatrics,Université de Montréal

Summary

Hier bieten wir eine kostengünstige und zuverlässige Methode um elektroporiert Gehirn organotypischen Slice Kulturen von mäuseembryonen geeignet für konfokale Mikroskopie und Leben-bildgebende Verfahren zu generieren.

Abstract

Gabaergen Interneuronen (INs) sind wichtige Komponenten der neuronalen Netzwerke, die Kognition und Verhalten zu steuern. Dazu bestimmt, den Kortex bevölkern INs migrieren tangential aus ihren Herkunftsort in der ventralen Telencephalon (u. a. aus der medialen und kaudalen ganglionic Eminenzen (MGE, CGE)), um die dorsale kortikale Platte in Reaktion auf eine Vielzahl von inneren und äußeren Hinweise. Verschiedene Methoden wurden im Laufe der Jahre zu genetisch bestimmte Wege zu manipulieren und zu untersuchen, wie sie die dynamische Zellskelett Änderungen erforderlich, für eine ordnungsgemäße regulieren IN der Migration. In Utero Elektroporation wurde ausgiebig genutzt, um die Wirkung des Gens Repression zu untersuchen oder Überexpression in spezifischen IN Subtypen bei der Bewertung der Auswirkungen auf Morphologie und Endposition. Jedoch während dieser Ansatz leicht Radial wandernde Pyramidenzellen ändern verwendet wird, ist es technisch schwierig wenn targeting VG In Utero Elektroporation eine geringe Ausbeute angesichts der verringerten Überlebensraten von Welpen erzeugt bei Elektroporation ist vor e14.5, wie üblich bei MGE-abgeleitete INs Studium durchgeführt. In einem alternativen Ansatz MGE Explantaten bieten einen einfachen Zugang zu den MGE und erleichtern die Darstellung der gentechnisch veränderten INs. Jedoch in diesen Explantaten INs Wandern in eine künstliche Matrix, frei von endogenen Anleitung Cues und thalamische Eingänge. Dies veranlasste uns, eine Methode zu optimieren, wo INs in einer Umgebung mit naturalistischer migrieren können, unter Umgehung der technischen Herausforderungen in Utero Ansätze. In diesem Artikel beschreiben wir die Kombination von Ex Utero Elektroporation von embryonalen mäusegehirnen gefolgt von organotypischen Slice Kulturen leicht nachverfolgen, Bild und gentechnisch veränderten INs entlang ihrer natürlichen Wege als Reaktion auf die Migration zu rekonstruieren körpereigene Signale. Dieser Ansatz ermöglicht die Quantifizierung die dynamischen Aspekte der Migration mit Time-Lapse confocal Imaging sowie die detaillierte Analyse der verschiedenen morphologischen Parameter mithilfe neuronale Rekonstruktionen auf festen Immunolabeled Gewebe.

Introduction

Kortikale Gabaergen Interneuronen (INs) sind vielfältig in Bezug auf ihre biochemische Eigenschaften, physiologische Eigenschaften und Konnektivität, und sie vermitteln verschiedene Funktionen im Reifen Netzwerke1,2,3 ,4,5. Die Spezifikation der verschiedenen Subtypen der kortikalen INs ist streng reguliert durch genetische Kaskaden, die ausgiebig studiert1,2. Die Mehrheit (70 %) der kortikalen GABAergic INs stammen von Vorfahren in der medialen ganglionic Eminenz (MGE), eine ventral befindet sich embryonale Struktur und muss migrieren über relativ große Entfernungen auf die kortikale Platte1, zu erreichen 2 , 6. während kortikale Pyramidenzellen Radial auf die kortikale Platte entlang der radialen Glia-Gerüst aus der ventrikulären Zone (VZ) migrieren, die tangentiale Migration ins, die nicht zu solch einem Gerüst befestigt sind, erfordert eine Vielzahl von inneren und extrinsische Signale zu Migration von Neuronen in Richtung der kortikalen Platte zu gewinnen, und führen sie weg von nicht-kortikale Strukturen2,7,8. Nach Verlassen des Zellzyklus, INs sind abgestoßen von der MGE von Chemo-abstoßende Signale innerhalb der VZ MGE, tangentialer Übergang zu den kortikalen Platte9,10auslöst. Migration INs vermeiden das Striatum mit Hilfe von verschiedenen abstoßende Signale11 und, nach Erreichen der kortikalen Platte, sie wechseln Sie von einen tangential zu radial Migrationsmodus und erreichen ihre laminar Endlage, teils in Erwiderung auf Signale von Pyramiden Zellen12 und anderen zellularen Bevölkerungen13. Die Migration von INs, wie bei anderen neuronalen Populationen beinhaltet verschiedene dynamische morphologische Veränderungen um die tatsächliche Bewegung des Neurons zu ermöglichen. Diese so genannte neuronale Fortbewegung zeichnet sich durch sich wiederholende Zyklen von drei aufeinander folgenden Schritten: die Dehnung von einem führenden Prozess, eine aktive Anterograde Bewegung des Kerns (Nucleokinesis) und das Einfahren der nachfolgende Prozess14. BEI der Migration wird durch zahlreiche intrinsische und extrinsische Signale reguliert, die Verzweigungen und aktive Umgestaltung des führenden Prozesses INs führen in die richtige Richtung, Bestimmung, Ausrichtung und Geschwindigkeit der Migration14,15 fahren ,16.

Die Determinanten, die Regulierung der kortikalen Migration haben in den letzten Jahren1,2,7,17,18,19,20ausführlich untersucht, und Störungen in einigen dieser molekularen Akteure hat postuliert, führen zu Entwicklungsstörungen des, wie pädiatrische refraktäre Epilepsie oder Autismus Spektrum Störungen1,2,21, 22 , 23 , 24. daher die Entwicklung von in Vitro und in Vivo Ansätzen verfolgt wurden, um unsere Fähigkeit, dieser dynamischen Prozess, wie zuvor bewertete25erheblich voranbringen. In-vitro- Methoden, einschließlich der Boyden Kammer Assay und der Streifen-Wahl-Test bieten die schnellste und die meisten reproduzierbare Mittel zur Bewertung der Anforderung und Zelle-autonome Auswirkungen von bestimmten Genen oder Proteinen während der neuronalen Migration, ohne der Einfluss anderer Faktoren25. Diese Tests sind besonders nützlich in Kombination mit live-Imaging8,26,27. Mit diesen Techniken INs leicht aus e13.5 MGE abgerufen und durch enzymatische und mechanische Dissoziation, wonach verschiedene Signalwege und Anleitung Hinweise untersucht werden können, isoliert, wie zuvor dargestellt,8,28 . Doch statt diese Assays in eine künstliche extrazelluläre Matrix in Ermangelung von dreidimensionalen Gewebearchitektur, die neuronale Verhalten und Zelle Eigenschaften potenziell beeinflussen Zelle Migration und/oder überleben25verändern kann. Um diese Einschränkungen zu umgehen, wurden als alternative Instrument zur Quantifizierung der dynamischen morphologische Veränderungen während der Migration zusammen mit Parametern wie Geschwindigkeit und Orientierung14 Ex Vivo MGE Explantaten entwickelt, 29. Generierung von MGE Explantaten ist relativ einfach und wurde ausgiebig30an anderer Stelle beschrieben. Es umfasst die Beschichtung ein kleiner Auszug der MGE auf einem monomolekularen Film gemischte kortikale Zellen oder in einem Gemisch von Matrigel und Kollagen in Anwesenheit von anziehend oder abstoßend Cues25, obwohl letztere optional31 sind. MGE Explantaten ermöglichen hochauflösende Bildgebung des spärlich markierten Zellen, Vereinfachung der Studie von intrazellulären Prozessen, wie Zellskelett Umbau bei führenden Verzweigungen, wie zuvor gezeigt,32,33 ,34 und in der vorliegenden Studie. MGE Explantate sind erfolgreich benutzt worden, um dynamische Zellskelett Veränderungen während der Migration in einer 2D Umgebung, zum Beispiel nach bestimmten pharmakologischen oder chemotaktische Manipulationen zu beurteilen (siehe z. B. Tielens Et Al. 201633) . Aber mit diesem Ansatz INs Wandern innerhalb einer künstlichen Matrix, und dies könnte IN Verhalten und die Reproduzierbarkeit und die Bedeutung der experimentellen Ergebnisse verändern.

Im Gegensatz dazu in Utero Elektroporation ermöglicht die genetische Manipulation von INs in ihrer natürlichen Umgebung und ist eine weit verbreitete Methode, um schnell und effizient die Auswirkungen von Gewinn und Verlust der Genfunktion beurteilen unter Umgehung der Beschränkungen des Kosten- und zeitintensive Knockout und Knock-in Strategien25,35. In Utero Elektroporation kann auf IN Stammväter indem Zelle Art spezifische Promotoren und Positionierung der Elektroden in Richtung ventromedialen Strukturen, einschließlich die MGE36voreingenommen sein. Darüber hinaus Elektroporation ermöglicht die rechtzeitige Ausdruck der experimentellen Konstrukte innerhalb von 1-2 Tagen, Vektoren in der Gebärmutter im Vergleich zu den 7-10 Tage benötigt, Konstrukt Ausdruck virale25. Jedoch tendenziell in Utero Elektroporation von IN Stammväter geringer Sprengkraft. In der Tat, obwohl pyramidale Zelle Vorfahren liegt in der dorsalen ventrikuläre Zone effizient transfiziert werden können ist in der Gebärmutter mit Elektroporation, targeting mehr ventral befindet sich Strukturen, z. B. die MGE mehr technisch anspruchsvoll, vor allem in kleinen e13.5 reduziert Embryonen und die hohe Rate der embryonalen Tödlichkeit weiter die experimentelle Ertrag25.

Zur Umgehung der technischen Einschränkungen verbunden mit in-vitro- MGE explant Experimente und in Vivo im Mutterleib Elektroporation, ex Vivo organotypischen Slice Kulturen wurden entwickelten8,37, 38,39. Gehirn organotypischen Slice Kulturen bieten der Vorteil der Nachahmung in Vivo Bedingungen während weniger teuer und zeitaufwendig als Erzeugung von25 Tiermodelle. In der Tat, diese Präparate ermöglichen einen einfachen Zugang zu den MGE, zusammen mit der spezifischen Visualisierung von INs, und ist kombinierbar mit fokalen Elektroporation, spezifische Molekulare Signalwege im INs Migration in einem mehr physiologische Umgebung8 zu untersuchen , 39 , 40 , 41. Wir haben deshalb einen Ansatz für organotypischen Kulturen38, die wir mit Ex Utero Electroporation und Time-Lapse confocal Imaging kombiniert optimiert, zur weiteren Beurteilung die morphologischen und dynamischer Prozess auftretenden bei der tangentialen Migration von MGE-INs. Dieses Protokoll wurde angepasst und optimiert von anderen, die Ex Utero oder in Utero Gehirn Electroporation und organotypischen Slice Kulturen verwendet, um die Migration von Pyramidenzellen42,43 zu studieren und kortikale INs36,39,44. Insbesondere mausembryonen enthauptet und die MGE ist elektroporiert Ex Vivo nach der intraventrikulären Injektion von den experimentellen Plasmiden ermöglicht effizientes und präzises targeting von MGE Stammväter als erreichten mit in Utero Elektroporation. Die Köpfe werden dann extrahiert und geschnitten in Gesamt-Hirn koronalen Scheiben, die für ein paar Tage kultiviert werden können, wodurch die kontinuierliche tracking und imaging-transfizierten ins. Dieser Ansatz kennzeichnet in der Regel 5-20 tangential Migration INs pro Gehirn-Scheibe, die Minimierung von experimentellen Iterationen erforderlich, um die statistischen Signifikanz zu erreichen, während die Kennzeichnung einer ausreichend spärlichen neuronalen Bevölkerung dafür einfache Trennung von einzelner Neuronen für Wiederaufbau und feine morphologische Beurteilung. Darüber hinaus im Vergleich zu MGE Explantaten organotypischen Kulturen zu gewährleisten, dass Migration INs ausgesetzt sind ein natürlicher Umgebung, einschließlich lokal sezernierten Chemokine und Inputs thalamische afferenzen. Dieser Ansatz eignet sich daher gut zur Direktionalität und wandernden Weg angenommenen transfizierten INs, bietet ausreichend anatomische Details ermöglicht die Charakterisierung der feineren dynamische Prozesse wie führende Prozess Verzweigung zu quantifizieren, Nucleokinesis und nachgestellten Prozess zurückziehen.

Protocol

Alle Experimente mit Tieren vom Comité Institutionnel des Bonnes Pratiques Avec Les Animaux de Recherche (CIBPAR) am Forschungszentrum CHU Sainte-Justine genehmigt und wurden im Einklang mit dem Canadian Council über Animal Care Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren (Ed. 2). Das hier beschriebene Protokoll wurde optimiert für Elektroporation von Embryonen im embryonalen Tag (e) 13,5, zu einem Zeitpunkt wann MGE abgeleitet INs aktiv erzeugt werden, bevor die Spitze der …

Representative Results

In diesem Abschnitt bieten wir repräsentative Ergebnisse nach der Ex Utero Elektroporation ein Steuerelement Plasmid oder eine experimentelle Plasmid Ausrichtung auf ein Gen des Interesses an der MGE e13.5 mausembryonen gefolgt von organotypischen Slice Kulturen bei 37 ° C für 48 h (für Zeitraffer-Tomographie) oder 72 h (für Fixierung und immunhistochemische Kennzeichnung) inkubiert (siehe Abbildung 1 b schematische Protokoll). Repräsentative B…

Discussion

In diesem Artikel bieten wir eine zuverlässige Methode für die Durchführung von ex Utero Elektroporation der Maus MGE in e13.5 und zur Erzeugung von organotypischen Kulturen der embryonalen Gehirnscheiben. Obwohl in-vitro- Methoden, z. B. Boyden Kammer Assay, relativ einfach sind durchzuführen und verwendet werden, können um die spezifischen Rollen von verschiedenen Genen und Proteinen ohne die Einmischung von anderen Faktoren zu beurteilen, schließen sie die Untersuchung IN Migration-Dynamik im H…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von Betriebskostenzuschüssen von Savoy-Stiftung und der Heilung-Epilepsie-Stiftung unterstützt und durch Ausrüstung gewährt der kanadischen Stiftung für Innovation E.R (confocal Mikroskop) und G.H (Spinning Disk confocal Mikroskop). E.r. erhält einen Karriere-Award von der Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S; Clinician-Scientist Award) sowie von der Canadian Institute for Health Research (CIHR; Young Investigator Award). G.h. ist ein senior Scholar des FRQ-S. L.E ist der Empfänger des Steriade-Savoy Postdoc Training Award der Savoy-Stiftung, Postdoc Training CHU Sainte-Justine Stiftungspreis und FRQ-S Postdoc Bildungspreis, in Partnerschaft mit der Stiftung der Sterne. Dieses Projekt wurde vom Gehirn Kanada durch Kanada Brain Research Fund, mit finanzieller Unterstützung von Health Canada, verliehen an l.e. ermöglicht

Materials

Neurobasal Medium ThermoFisher Scientific 21103049 Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html
B-27 serum-free supplement ThermoFisher Scientific 17504044 50X Serum-free neuron specific supplement
15 mL sterile centrifuge tubes Sarstedt 62.554.002
Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine) ThermoFisher Scientific 11415064 Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor's website 
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
Horse serum, heat inactivated Millipore-Sigma H1138-500ML
Neurocell supplement N-2 100X Wisent 305-016 Botteinstein's N-2 Formulation
VWR Square PETG Media Bottles 125 mL VWR 89132-062
Class II Type A Biosafety Cabinet Nuaire NU-540
Sucrose BioShop SUC700.1
Sodium Chloride BioShop SOD001.1
Sodium bicarbonate ThermoFisher Scientific S233-500
D+ glucose Millipore-Sigma G7528-250G
Potassium Chloride ThermoFisher Scientific P217-500
Sodium phosphate monobasic anhydrous BioShop SPM400.500
Calcium chloride dihydrate  ThermoFisher Scientific C79-500
Magnesium sulfate heptahydrate BiosShop MAG522
Agarose BioShop AGA002.500
50 mL sterile centrifuge tubes Sarstedt 62.547.004
1.5 mL centrifuge tubes Sarstedt 72.690.001
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Model P-97
0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube Drummond scientific 1-000-800/12
Ethanol VWR E193
5 mL syringe Becton Dickinson & Co 309646
Mineral Oil (heavy) Rougier Pharma
WPI Swiss Tweezers #5 World Precision Instruments 504511 11 cm, straight, 0.06×0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these.
WPI Swiss Tweezers #7 World Precision Instruments 504504 11.5 cm, 0.18×0.2mm, curved tips
HTC Tweezers World Precision Instruments 504617 11 cm, Straight, flat
Operating scissors World Precision Instruments 501225 16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these.
Dressing Forceps World Precision Instruments 501217 12.5 cm, straight, serrated
Iris Forceps World Precision Instruments 504478 10.2 cm, full curve, serrated
DeBakey Tissue Forceps World Precision Instruments 501996 15 cm, 45° angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide
Fisherbran Microspatula with rounded ends FisherScientific 21-401-5 You will need 2 of these.
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector Drummond scientific 3-000-204
TC Dish 60, Standard Sarstedt 83.3901 60-mm dish
Tissue culture dish Sarstedt 83.1800 35-mm dish
Black Wax FisherScientific S17432
Transfer pipettes  Ultident 170-CTB700-212 3 mL, small bulb
Stereo Microscope Leica Biosystems Leica M80 In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific)
Electro Square Porator BTX Harvard Apparatus ECM 830
Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm BTX Harvard Apparatus 45-0487
25G 1 1/2 Becton Dickinson & Co 305127
Leica VT1000S Vibrating blade microtome Leica Biosystems VT1000S
GEM, Single edge razor blade Electron Microscopy Sciences 71952-10 Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome
µ-Slide 8 well Ibidi 80827 Pack of 15
Millicell cell culture insert Millipore-Sigma PICM0RG50 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore, pack of 50. 
Leica DMi6000 microscope Leica Microsystems N/A
Spinning disk confocal head Ultraview Vox Perkin Elmer N/A
Volocity 6.0 acquisition software Improvision/Perkin Elmer N/A
LiveCell Stage top incubation system Pathology devices LC30030 Provides Temperature, CO2 and humidity control. 
SP8 confocal microscope Leica
mCherry-Lifeact-7 Addgene 54491 Gift from Michael Davidson
Fast Green FCF Millipore-Sigma F7258-25G 25G bottle, certified by the Biological Stain Commission
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Eid, L., Lachance, M., Hickson, G., Rossignol, E. Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons. J. Vis. Exp. (134), e57526, doi:10.3791/57526 (2018).
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