Ex útero Electroporación y culturas Organotypic rebanada de cerebros embrionarios de ratón para vivir-la proyección de imagen de interneuronas GABAérgicas de migrando
Summary
Aquí, nos proporcionan un método confiable y de bajo costo para generar culturas de electroporated cerebro organotypic rebanada de embriones de ratón adecuados para microscopía confocal y técnicas de imagen en vivo.
Abstract
Interneuronas GABAérgicas (INs) son componentes esenciales de las redes neuronales que cognición y comportamiento. INs destinada a rellenar la corteza migrar tangencialmente de su lugar de origen en el telencéfalo ventral (incluyendo de las eminencias ganglionares mediales y caudales (MGE, CGE)) a la placa cortical dorsal en respuesta a una variedad de intrínseco y extrínseco señales. Diferentes metodologías se han desarrollado en los años genético manipular vías específicas e investigar cómo regulan los cambios citoesqueléticos dinámicos necesarios para la correcta migración. En el útero de la electroporación se ha utilizado ampliamente para estudiar el efecto de la represión del gen o sobreexpresión en IN específico subtipos al evaluar el impacto en la morfología y posición final. Sin embargo, mientras que este enfoque se utiliza fácilmente modificar radialmente migración de las células piramidal, es técnicamente más difícil cuando dirigidos a electroporación pulg en el útero genera un bajo rendimiento dado las tasas de disminución de la supervivencia de los cachorros cuando la electroporación se lleva a cabo antes de e14.5, como es habitual al estudiar INs derivados de MGE. En un enfoque alternativo, MGE explantes proporcionan un fácil acceso al MGE y facilitan la proyección de imagen de INs modificados genéticamente. Sin embargo, en estos explantes, INs emigran en una matriz artificial, carente de orientación endógena claves y entradas talámicas. Esto nos incitó a optimizar un método donde el INs puede migrar en un ambiente más naturalista, al eludir los desafíos técnicos de los enfoques en el útero . En este papel, describimos la combinación de la electroporación ex útero de ratón embrionario cerebro seguido organotypic rebanada culturas fácilmente, imagen y reconstruir genéticamente modificados INs migrando a lo largo de sus senderos naturales en respuesta a señales endógenas. Este enfoque permite tanto la cuantificación de los aspectos dinámicos de migración con la proyección de imagen confocal Time-lapse, así como el análisis detallado de diversos parámetros morfológicos usando reconstrucciones neuronales tejido immunolabeled fijo.
Introduction
Interneuronas GABAérgicas corticales (INs) son diversos en cuanto a sus propiedades bioquímicas, propiedades fisiológicas y conectividad, y median diversas funciones en redes maduro1,2,3 ,4,5. La especificación de subtipos diferentes de INs cortical es estrictamente regulada a través de cascadas genéticas que han sido extensivamente estudiados1,2. La mayoría (70%) de los INs GABAérgicas corticales origina de progenitores en la eminencia ganglionar medial (MGE), una estructura embrionaria ubicada ventralmente y debe migrar a través de distancias relativamente largas para llegar a la placa cortical1, 2 , 6. mientras que las células piramidales corticales migran radialmente desde la zona ventricular (VZ) a la placa cortical a lo largo del andamio de la glia radial, la migración tangencial del INs, que no están vinculados a estos andamios, requiere una variedad de intrínseca y señales extrínsecas para atraer las neuronas migrantes hacia la placa cortical, al mismo tiempo guiándolos lejos de estructuras no corticales2,7,8. Después de salir del ciclo celular, INs son repelidos de la MGE por quimio-repulsivo señales expresadas en VZ de MGE, que desencadena la migración tangencial a la placa cortical9,10. Migración de INs evitar el estriado con la ayuda de diferentes señales repulsivas11 y, después de llegar a la placa cortical, cambia de una tangencial a una migración radial y llegar a su posición final laminar, en parte en respuesta a señales del piramidal las células de12 y otras poblaciones celulares13. La migración de los INs, en cuanto a otras poblaciones neuronales, implica varios cambios morfológicos dinámicos para permitir el movimiento real de la neurona. Este supuesto locomoción neuronal se caracteriza por ciclos repetitivos de tres pasos sucesivos: el alargamiento de un proceso principal, un movimiento activo anterograde del núcleo (nucleokinesis) y la retracción del proceso final14. EN migración está regulada por numerosas señales intrínsecas y extrínsecas que la ramificación y la remodelación activa del proceso principal para guiar el INs en la dirección correcta, determinar la orientación y la velocidad de migración14,15 ,16.
Los determinantes de regulación cortical en la migración se han estudiado ampliamente en los últimos años1,2,7,17,18,19,20 y alteración en algunos de estos agentes moleculares se ha postulado para dar lugar a trastornos del neurodesarrollo, como el pediátrico refractaria epilepsia o Autismo espectro trastornos1,2,21, 22 , 23 , 24. por lo tanto, el desarrollo de diversos enfoques in vitro e in vivo se ha seguido para impulsar significativamente nuestra capacidad para el estudio de este proceso dinámico, como previamente ha25. Los métodos in vitro , incluyendo el análisis de la cámara de Boyden y el análisis de la elección de raya, proporcionan el medio más rápido y más reproducible de evaluación del requisito e impacto célula Autónoma de proteínas o genes específicos durante la migración neuronal, sin la influencia de otros factores25. Estos ensayos son particularmente útiles cuando se combinan con imágenes en vivo8,26,27. Con estas técnicas, son fácilmente Obtenido de e13.5 MGE y aislado por la disociación enzimática y mecánica, después de que se pueden investigar diferentes vías de señalización y señales de orientación, como se ilustra anteriormente8,28 . Sin embargo, estos ensayos tienen lugar en una matriz extracelular artificial en la ausencia de la arquitectura tridimensional del tejido, que puede modificar propiedades de comportamiento y de la célula neuronales, afectando potencialmente a migración y supervivencia de la célula25. Para evitar estas limitaciones, los explantes MGE ex vivo se han desarrollado como una herramienta alternativa para cuantificar los dinámicos cambios morfológicos que ocurren durante la migración junto con parámetros como la velocidad y orientación14, 29. Generación de MGE explantes es relativamente sencilla y ha sido ampliamente descrito en otra parte30. Implica la chapa de un pequeño extracto de la MGE en una monocapa de células corticales mixtas o en una mezcla de matrigel y colágeno en presencia de señales atractivo o repulsivo25, siendo este último opcional31. MGE explantes permiten alta resolución imágenes de células escasamente marcadas, simplificar el estudio de los procesos intracelulares, como remodelación citoesqueleto durante proceso principales de ramificación, como se mostró anteriormente32,33 ,34 y en el presente estudio. Explantes MGE se han utilizado con éxito para evaluar cambios dinámicos del citoesqueleto durante la migración en un entorno 2D, por ejemplo después de manipulaciones farmacológicas o quimiotácticas específicas (véase, por ejemplo, Tielens et al 201633) . Sin embargo, con este enfoque, INs migran dentro de una matriz artificial, y esto podría alterar en comportamiento y la reproducibilidad y el significado de los resultados experimentales.
Por el contrario, en el útero la electroporación permite la manipulación genética de los INs en su ambiente nativo y es un método ampliamente usado para evaluar rápida y eficientemente el impacto de la ganancia y pérdida de función del gen mientras que eludir las limitaciones de golpe de gracia costosa y desperdiciadora de tiempo y knock-in estrategias25,35. Electroporación en el útero puede ser inclinada hacia en progenitores mediante el uso de promotores específicos de tipo celular y colocando los electrodos hacia las estructuras ventromedial, incluyendo el MGE36. Además, en el útero la electroporación permite la oportuna expresión de construcciones experimentales en 1-2 días, en comparación con el 7-10 días necesarios para la construcción de expresión utilizando viral vectores25. Sin embargo, en el útero la electroporación de en progenitores tiende a ser bajo rendimiento. De hecho, si bien progenitores de células piramidales en la zona ventricular dorsal pueden ser transfectadas eficientemente usando en el útero electroporación, dirigidas a las estructuras más ventral situadas, como el MGE, es más técnicamente difícil, especialmente en pequeños e13.5 embriones y la alta tasa de letalidad embrionaria más reduce el rendimiento experimental25.
Para eludir algunas de las limitaciones técnicas asociadas con in vitro MGE presentaron experimentos y electroporación en vivo en el útero , ex vivo organotypic rebanada culturas se han desarrollado8,37, 38,39. Cerebro organotypic rebanada culturas ofrecen la ventaja de la mímica en vivo de las condiciones, mientras que siendo menos costosos y desperdiciadores de tiempo de modelos de animales genera25. De hecho, estas preparaciones permiten un acceso fácil a la MGE, junto con la visualización específica del INs y pueden combinarse con electroporación focal para investigar vías moleculares específicas en INs migración en medio ambiente más fisiológico8 , 39 , 40 , 41. por lo tanto, hemos optimizado una aproximación por organotypic culturas38, que combinamos con electroporación ex utero y la proyección de imagen confocal Time-lapse, para evaluar el proceso morfológico y dinámico que ocurre durante la migración tangencial de MGE-INs. El presente Protocolo fue adaptado y optimizado de otros que han usado ex útero o en el útero cerebro electroporación organotypic rebanada culturas y estudiar la migración de las células piramidales42,43 y cortical INs36,39,44. Específicamente, embriones de ratón son decapitados y el MGE es electroporated ex vivo después de la inyección intraventricular de la plásmidos experimental, lo que permite más eficiente y precisa selección de progenitores MGE que lo que puede lograrse con electroporación en el útero . Luego se extraen los cerebros y seccionado en rebanadas coronales todo el cerebro que pueden ser cultivados por unos pocos días, lo que permite la continua seguimiento y proyección de imagen de transfected INs. Este enfoque etiquetas típicamente 5-20 INs migración tangencial por rebanada del cerebro, minimizando el número de iteraciones experimentales necesaria para alcanzar significación estadística, mientras etiquetado una población neuronal lo suficientemente escasa para asegurar la fácil separación de neuronas individuales para la reconstrucción y evaluación morfológica fina. Además, en comparación con explantes MGE, culturas organotypic aseguran que migrar INs están expuestos a un ambiente más natural, incluyendo entradas de aferentes talámicos y quimiocinas secretadas localmente. Este enfoque es apropiado para cuantificar la direccionalidad y la ruta migratoria adoptada por INs transfected, ofreciendo información anatómica suficiente para permitir la caracterización de procesos dinámicos más finos como principal proceso de ramificación, nucleokinesis y al final proceso de retracción.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo, nos proporcionan un método confiable para realizar ex útero electroporación del ratón MGE en e13.5 y para la generación de culturas organotypic de rebanadas del cerebro embrionario. Aunque en vitro métodos, tales como el análisis de la cámara de Boyden, son relativamente fáciles de realizar y pueden utilizarse para evaluar los roles específicos de diferentes genes y proteínas sin la interferencia de otros factores, impide la investigación de IN dinámica de migración con …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de Saboya y la Fundación de epilepsia de la curación de funcionamiento y por el equipo de becas de la Fundación Canadiense para la innovación E.R (microscopio confocal) y G.H (microscopio confocal de disco de spinning). E.R. recibe un premio de carrera de la Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S; Premio clinician-Scientist) así como de los institutos canadienses de investigación en salud (CIHR; Premio al investigador joven). G.H. es un erudito principal del FRQ-S. L.E es el destinatario del Premio Steriade Saboya posdoctoral de la Fundación de Saboya, la formación postdoctoral CHU Sainte-Justine Fundación y el Premio de formación postdoctoral FRQ-S, en colaboración con la Fundación de las estrellas. Este proyecto ha sido posible por el Canadá de cerebro a través del fondo de investigación cerebral de Canadá, con el apoyo financiero de Canadá de la salud, otorgado a L.E.
Materials
| Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html |
| B-27 serum-free supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | 50X Serum-free neuron specific supplement |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11415064 | Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor's website |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Horse serum, heat inactivated | Millipore-Sigma | H1138-500ML | |
| Neurocell supplement N-2 100X | Wisent | 305-016 | Botteinstein's N-2 Formulation |
| VWR Square PETG Media Bottles 125 mL | VWR | 89132-062 | |
| Class II Type A Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-540 | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.1 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.1 | |
| Sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| D+ glucose | Millipore-Sigma | G7528-250G | |
| Potassium Chloride | ThermoFisher Scientific | P217-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | BioShop | SPM400.500 | |
| Calcium chloride dihydrate | ThermoFisher Scientific | C79-500 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | BiosShop | MAG522 | |
| Agarose | BioShop | AGA002.500 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Model P-97 | |
| 0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube | Drummond scientific | 1-000-800/12 | |
| Ethanol | VWR | E193 | |
| 5 mL syringe | Becton Dickinson & Co | 309646 | |
| Mineral Oil (heavy) | Rougier Pharma | ||
| WPI Swiss Tweezers #5 | World Precision Instruments | 504511 | 11 cm, straight, 0.06×0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these. |
| WPI Swiss Tweezers #7 | World Precision Instruments | 504504 | 11.5 cm, 0.18×0.2mm, curved tips |
| HTC Tweezers | World Precision Instruments | 504617 | 11 cm, Straight, flat |
| Operating scissors | World Precision Instruments | 501225 | 16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these. |
| Dressing Forceps | World Precision Instruments | 501217 | 12.5 cm, straight, serrated |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 504478 | 10.2 cm, full curve, serrated |
| DeBakey Tissue Forceps | World Precision Instruments | 501996 | 15 cm, 45° angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide |
| Fisherbran Microspatula with rounded ends | FisherScientific | 21-401-5 | You will need 2 of these. |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond scientific | 3-000-204 | |
| TC Dish 60, Standard | Sarstedt | 83.3901 | 60-mm dish |
| Tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800 | 35-mm dish |
| Black Wax | FisherScientific | S17432 | |
| Transfer pipettes | Ultident | 170-CTB700-212 | 3 mL, small bulb |
| Stereo Microscope | Leica Biosystems | Leica M80 | In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific) |
| Electro Square Porator | BTX Harvard Apparatus | ECM 830 | |
| Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | |
| 25G 1 1/2 | Becton Dickinson & Co | 305127 | |
| Leica VT1000S Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| GEM, Single edge razor blade | Electron Microscopy Sciences | 71952-10 | Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome |
| µ-Slide 8 well | Ibidi | 80827 | Pack of 15 |
| Millicell cell culture insert | Millipore-Sigma | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore, pack of 50. |
| Leica DMi6000 microscope | Leica Microsystems | N/A | |
| Spinning disk confocal head Ultraview Vox | Perkin Elmer | N/A | |
| Volocity 6.0 acquisition software | Improvision/Perkin Elmer | N/A | |
| LiveCell Stage top incubation system | Pathology devices | LC30030 | Provides Temperature, CO2 and humidity control. |
| SP8 confocal microscope | Leica | ||
| mCherry-Lifeact-7 | Addgene | 54491 | Gift from Michael Davidson |
| Fast Green FCF | Millipore-Sigma | F7258-25G | 25G bottle, certified by the Biological Stain Commission |
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