Ex Utero Électroporation et culture organotypique tranche de cerveaux de souris embryonnaires pour vivre-imagerie de la migration des interneurones GABAergiques
Summary
Ici, nous fournissons une méthode fiable et peu coûteuse pour générer organotypiques électroporation cerveau d’embryons de souris appropriés pour la microscopie confocale et techniques d’imagerie en direct.
Abstract
Interneurones GABAergiques (INs) sont des composantes essentielles des réseaux neurones qui animent la cognition et le comportement. INs destiné à alimenter le cortex migrent tangentiellement depuis leur lieu d’origine dans le télencéphale ventral (y compris des éminences ganglionnaires médiales et caudales (MGE, CGE)) à la plaque corticale dorsale en réponse à une variété d’intrinsèques et extrinsèques indices. Différentes méthodes ont été développées au cours des années à manipuler des voies spécifiques et étudier comment ils règlent les changements cytosquelettiques dynamiques requis pour la bonne génétiquement en migration. In utero électroporation a été largement utilisée pour étudier l’effet de la répression génique ou des sous-types de surexpression à IN spécifique tout en évaluant l’impact sur la morphologie et position finale. Cependant, alors que cette approche est facilement permettant de modifier les cellules pyramidales radialement migration, il est techniquement plus difficile lorsque Assur In utero électroporation de ciblage génère un rendement faible, étant donné les taux de diminution de la survie des petits lorsque électroporation a lieu avant la e14.5, comme d’habitude lorsque l’on étudie les INs dérivé de MGE. Dans une approche alternative, MGE explants permettent d’accéder facilement à la MGE et facilitent l’imagerie des INs génétiquement modifiés. Toutefois, dans ces explants, INs migrer dans une matrice artificielle, dépourvu de repères d’orientation endogène et thalamiques entrées. Cela nous a amenés à optimiser une méthode où les INs peuvent migrer dans un environnement plus naturaliste, tout en contournant les défis techniques de in utero des approches. Dans cet article, nous décrivons la combinaison de l’ex utero électroporation de cerveaux de souris embryonnaire suivie organotypiques facilement la voie ferrée, image et reconstruire génétiquement modifiés INs migrant le long de leur parcours naturels en réponse à signaux endogènes. Cette approche permet pour les deux la quantification des aspects dynamiques de migration avec l’imagerie confocale Time-lapse, ainsi que l’analyse détaillée des différents paramètres morphologiques à l’aide de reconstitutions neuronales sur les tissus immunomarquées fixe.
Introduction
Corticales interneurones GABAergiques (INs) sont diverses en ce qui concerne leurs propriétés biochimiques, connectivité et les propriétés physiologiques et ils véhiculent des fonctions différentes dans des réseaux matures1,2,3 ,4,5. La spécification de différents sous-types des INs corticale est étroitement contrôlée par le biais de cascades génétiques qui ont été étudiés1,2. La majorité (70 %) des corticales GABAergic INs proviennent de géniteurs dans l’éminence ganglionnaire médial (MGE), une structure embryonnaire située sur le ventre et doit migrer sur des distances relativement longues pour atteindre la plaque corticale1, 2 , 6. tandis que les cellules pyramidales corticales migrent radialement de la zone ventriculaire (VZ) à la plaque corticale le long de l’échafaudage de la glie radiale, la migration tangentielle de l’INs, qui ne sont pas attachés à un tel échafaudage, exige une variété d’intrinsèque et signaux extrinsèques pour attirer la migration des neurones vers la plaque corticale, tout en guidant des structures corticales non2,7,8. Après la sortie du cycle cellulaire, INs sont repoussés de la MGE par chimio-répulsive repères exprimées au sein de la VZ de la MGE, qui déclenche la migration tangentielle vers la plaque corticale9,10. La migration INs éviter le striatum avec l’aide de différents indices répulsive11 et, après avoir atteint la plaque corticale, ils passer d’une tangente à un mode de migration radial et atteint leur position finale laminaire, en partie en réponse aux signaux du pyramidal les cellules12 et autres populations cellulaires13. La migration de l’INs, en ce qui concerne les autres populations neuronales, implique divers changements morphologiques dynamiques afin de permettre le mouvement réel du neurone. Ce que l’on appelle locomotion neuronale est caractérisée par des cycles répétitifs de trois étapes successives : l’allongement d’un processus de premier plan, un mouvement actif antérograde du noyau (nucleokinesis) et la rétraction de la fin du processus14. EN migration est réglementée par les nombreux signaux intrinsèques et extrinsèques qui alimentent la ramification et remodelage actif du processus de premier plan pour guider l’INs dans le bon sens, déterminer l’orientation et vitesse de migration14,15 ,,16.
Les déterminants de la régulation corticale en migration ont été largement étudiées ces dernières années1,2,7,17,18,19,20, et perturbation dans certains de ces acteurs moléculaires a été postulée à conduire à des troubles du développement neurologique, comme pédiatrique réfractaires épilepsie ou l’autisme du spectre des troubles1,2,21, 22 , 23 , 24. par conséquent, le développement de diverses approches in vitro et in vivo a été poursuivi pour faire avancer notre capacité à étudier ce processus dynamique, comme précédemment examiné25. Méthodes in vitro , y compris le test de chambre de Boyden et le test de choix Stripe, fournissent le moyen le plus rapide et plus reproductible d’évaluer le besoin et l’impact cellules autonomes de certains gènes ou de protéines au cours de la migration neuronale, sans l’influence d’autres facteurs25. Ces analyses sont particulièrement utiles lorsqu’il est combiné avec l’imagerie live8,26,27. Avec ces techniques, INs sont facilement Récupérée de e13.5 MGE et isolé par une dissociation enzymatique et mécanique, après quoi les différentes voies de signalisation et signaux de guidage peuvent être étudiées, tel qu’illustré précédemment8,28 . Cependant, ces essais ont lieu dans une matrice extracellulaire artificielle en l’absence d’architecture tissulaire en trois dimensions, qui peut modifier les propriétés neuronales de comportement et de la cellule, susceptibles d’influer sur cell migration et/ou survie25. Pour contourner ces limitations, les explants MGE ex vivo ont été développés comme outil de rechange pour quantifier les modifications morphologiques dynamiques survenant au cours de la migration ainsi que des paramètres tels que la vitesse et l’orientation14, 29. Génération d’explants de MGE est relativement simple et a été abondamment décrit ailleurs30. Elle implique le bordé d’un petit extrait de la MGE sur une monocouche de cellules corticales mixtes ou dans un mélange de matrigel et collagène en présence de signaux attractives ou répulsives25, même si ces derniers sont optionnels31. Des explants MGE permettant de haute résolution d’imagerie de cellules peu marquées, de simplifier l’étude des processus intracellulaires, comme le remodelage du cytosquelette durant les principaux processus de ramification, comme indiqué précédemment32,33 ,34 et dans la présente étude. MGE explants ont été utilisés avec succès pour évaluer les changements cytosquelettiques dynamiques lors de migration dans un environnement 2D, par exemple après des manipulations pharmacologiques ou chimiotactiques spécifiques (voir, par exemple, Tielens al 201633) . Cependant, avec cette approche, INs migrent au sein d’une matrice artificielle, et cela pourrait changer dans le comportement et la reproductibilité et la signification des résultats expérimentaux.
En revanche, dans l’utérus électroporation permet la manipulation génétique des INs dans leur milieu d’origine et est une méthode largement utilisée d’évaluer rapidement et efficacement l’impact du gain et la perte de la fonction du gène tout en contournant les limitations de knockout coûteuse et chronophage et knock-in stratégies25,35. In utero électroporation peut être biaisée vers en cellules souches à l’aide de promoteurs spécifiques de type cellulaire et en positionnant les électrodes vers des structures ventromédian, y compris le MGE36. En outre, dans l’utérus électroporation permet l’expression opportune de constructions expérimentales dans les 1-2 jours, comparativement aux 7-10 jours requis pour construire l’expression utilisant virale vecteurs25. Toutefois, dans l’utérus électroporation d’en progéniteurs tend à être de faible rendement. En effet, bien que les progéniteurs de cellule pyramidale situées dans la zone ventriculaire dorsale peuvent être efficacement transfectées utilisant in utero électroporation, ciblage des structures plus ventralement situés, comme le MGE, est techniquement plus difficile, surtout dans les petites e13.5 embryons et le taux de létalité embryonnaire plus élevé réduit le rendement expérimental25.
Pour contourner certaines limitations techniques associées en vitro MGE explantation des expériences et en vivo in utero électroporation, ex vivo organotypiques ont été développés8,37, 38,39. Cerveau organotypique tranche cultures offre l’avantage d’imiter en vivo les conditions, tout en étant moins long et coûteux que les modèles de production animaux25. En effet, ces préparations permettent un accès facile à la MGE, ainsi que la visualisation spécifique de l’INs et peuvent être combinées avec focale électroporation pour étudier les voies moléculaires spécifiques dans INs migration dans un plus physiologique environnement8 , 39 , 40 , 41. nous avons donc optimisé une approche pour organotypique cultures38, dont nous avons combiné avec l’ex utero électroporation et Time-lapse imagerie confocale, afin d’évaluer les processus morphologiques et dynamiques survenant au cours de la migration tangentielle de MGE-INs. Le présent protocole a été adapté et optimisé d’autres personnes qui ont utilisé des ex utero ou in utero cerveau électroporation organotypique tranche cultures et d’étudier la migration des cellules pyramidales42,43 et corticale INs36,39,44. Plus précisément, des embryons de souris sont décapités et la MGE est électroporation ex vivo après l’injection intraventriculaire des plasmides expérimentales, permettant aux plus précis et efficace ciblant des progéniteurs MGE que ce qui peut être réalisé avec dans l’utérus électroporation. Les cerveaux sont ensuite extraites et sectionnées en tranches coronale de cerveau entier qui peuvent être mis en culture pendant quelques jours, permettant ainsi continu de suivi et d’imagerie ins transfectées. Cette approche étiquettes généralement 5 à 20 tangentiellement migration INs par tranche de cerveau, réduisant au minimum le nombre d’itérations expérimentales nécessaires pour atteindre la signification statistique, tandis que l’étiquetage d’une population neuronale suffisamment rares pour assurer une séparation facile des neurones individuels pour la reconstruction et l’évaluation morphologique fine. En outre, par rapport à des explants MGE, culture organotypique assurer cette migration INs sont exposés à un environnement plus naturel, y compris les chimiokines sécrétée localement et contributions des afférences thalamiques. Cette approche est donc bien adaptée pour quantifier la directivité et la voie de migration adopté par INs transfectées, tout en offrant des détails anatomiques suffisantes pour permettre la caractérisation des processus dynamiques plus fines comme les principaux processus de branchement, nucleokinesis et rétraction fin de processus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cet article, nous fournissons une méthode fiable pour effectuer ex utero électroporation de souris MGE à e13.5 et pour la génération de culture organotypique de tranches de cerveau embryonnaire. Bien que les méthodes in vitro , tels que l’essai de chambre de Boyden, sont relativement faciles à effectuer et peuvent être utilisés pour évaluer les rôles spécifiques des différents gènes et des protéines sans l’interférence d’autres facteurs, ils s’opposent à l’enquête de po …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les subventions de la Fondation de la Savoie et la Fondation de l’épilepsie CURE de fonctionnement et de matériel des subventions de la Fondation canadienne pour l’Innovation aux E.R (microscope confocal) et Hary (microscope confocal à disque tournant). E.R. reçoit une bourse de carrière de la Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S ; Clinician-Scientist prix) ainsi que des instituts de recherche en santé du Canada (IRSC ; Prix du jeune chercheur). G.H. est chercheur principal de la FRQ-S. L.E est le récipiendaire du prix Steriade-Savoie formation postdoctorale de la Fondation de la Savoie, la bourse de formation postdoctorale de la Fondation CHU Sainte-Justine et la bourse de formation postdoctorale FRQ-S, en partenariat avec la Fondation des étoiles. Ce projet a été rendu possible par cerveau Canada à travers le Fonds de recherche de cerveau de Canada, avec l’appui financier de Santé Canada, attribué à L.E.
Materials
| Neurobasal Medium | ThermoFisher Scientific | 21103049 | Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html |
| B-27 serum-free supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | 50X Serum-free neuron specific supplement |
| 15 mL sterile centrifuge tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine) | ThermoFisher Scientific | 11415064 | Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor's website |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-081 | |
| Horse serum, heat inactivated | Millipore-Sigma | H1138-500ML | |
| Neurocell supplement N-2 100X | Wisent | 305-016 | Botteinstein's N-2 Formulation |
| VWR Square PETG Media Bottles 125 mL | VWR | 89132-062 | |
| Class II Type A Biosafety Cabinet | Nuaire | NU-540 | |
| Sucrose | BioShop | SUC700.1 | |
| Sodium Chloride | BioShop | SOD001.1 | |
| Sodium bicarbonate | ThermoFisher Scientific | S233-500 | |
| D+ glucose | Millipore-Sigma | G7528-250G | |
| Potassium Chloride | ThermoFisher Scientific | P217-500 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | BioShop | SPM400.500 | |
| Calcium chloride dihydrate | ThermoFisher Scientific | C79-500 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | BiosShop | MAG522 | |
| Agarose | BioShop | AGA002.500 | |
| 50 mL sterile centrifuge tubes | Sarstedt | 62.547.004 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette puller | Sutter Instruments Co. | Model P-97 | |
| 0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube | Drummond scientific | 1-000-800/12 | |
| Ethanol | VWR | E193 | |
| 5 mL syringe | Becton Dickinson & Co | 309646 | |
| Mineral Oil (heavy) | Rougier Pharma | ||
| WPI Swiss Tweezers #5 | World Precision Instruments | 504511 | 11 cm, straight, 0.06×0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these. |
| WPI Swiss Tweezers #7 | World Precision Instruments | 504504 | 11.5 cm, 0.18×0.2mm, curved tips |
| HTC Tweezers | World Precision Instruments | 504617 | 11 cm, Straight, flat |
| Operating scissors | World Precision Instruments | 501225 | 16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these. |
| Dressing Forceps | World Precision Instruments | 501217 | 12.5 cm, straight, serrated |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 504478 | 10.2 cm, full curve, serrated |
| DeBakey Tissue Forceps | World Precision Instruments | 501996 | 15 cm, 45° angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide |
| Fisherbran Microspatula with rounded ends | FisherScientific | 21-401-5 | You will need 2 of these. |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond scientific | 3-000-204 | |
| TC Dish 60, Standard | Sarstedt | 83.3901 | 60-mm dish |
| Tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800 | 35-mm dish |
| Black Wax | FisherScientific | S17432 | |
| Transfer pipettes | Ultident | 170-CTB700-212 | 3 mL, small bulb |
| Stereo Microscope | Leica Biosystems | Leica M80 | In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific) |
| Electro Square Porator | BTX Harvard Apparatus | ECM 830 | |
| Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | |
| 25G 1 1/2 | Becton Dickinson & Co | 305127 | |
| Leica VT1000S Vibrating blade microtome | Leica Biosystems | VT1000S | |
| GEM, Single edge razor blade | Electron Microscopy Sciences | 71952-10 | Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome |
| µ-Slide 8 well | Ibidi | 80827 | Pack of 15 |
| Millicell cell culture insert | Millipore-Sigma | PICM0RG50 | 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore, pack of 50. |
| Leica DMi6000 microscope | Leica Microsystems | N/A | |
| Spinning disk confocal head Ultraview Vox | Perkin Elmer | N/A | |
| Volocity 6.0 acquisition software | Improvision/Perkin Elmer | N/A | |
| LiveCell Stage top incubation system | Pathology devices | LC30030 | Provides Temperature, CO2 and humidity control. |
| SP8 confocal microscope | Leica | ||
| mCherry-Lifeact-7 | Addgene | 54491 | Gift from Michael Davidson |
| Fast Green FCF | Millipore-Sigma | F7258-25G | 25G bottle, certified by the Biological Stain Commission |
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