整合影像流式细胞仪和转录组分析, 评估改变的内吞 CD1d 贩运
Summary
成像流式细胞术提供了一种理想的方法来检测细胞在个体和种群水平的形态学和功能改变。对污染物暴露的人树突状细胞中脂质抗原表达的破坏内吞功能进行了转录组基因表达和蛋白质贩运形态表现的综合分析。
Abstract
种群分析内吞蛋白的形态和功能变化, 是由于单细胞水平的图像采集需求和种群水平的统计图像分析所带来的挑战。为了克服这一困难, 我们使用了成像流式细胞仪和转录组分析 (RNA 序列) 来确定分化1d 蛋白 (CD1d) 与人内吞基因表达受损相关的亚细胞定位树突状细胞 (DCs), 暴露于常见的亲油性空气污染物苯并 (a) 芘。用想法和 ImageJ-斐济方案分析了数以千计的细胞图像采集的 CD1d 和内吞标记 Lamp1 蛋白的共定位。在 CD1d+Lamp1+ DCs 的控制下, 使用 CD1d 和 Lamp1 蛋白的多种蜂窝图像进行了可视化处理。在 BaP 曝光时增强的 CD1d 和 Lamp1 共定位进一步证明使用阈值散点图, 用 Mander 的系数进行共局部强度测试, 并根据使用 ImageJ-斐济的共同本地化区域的百分比进行绘制。我们的数据提供了一种有利的工具和生物信息学方法, 用于测量单个和种群细胞水平的蛋白质共定位, 支持在污染物暴露的人类中转录组变化的功能性结果受损。Dcs。
Introduction
抗原呈现通常涉及细胞内蛋白的贩运, 这是经常调查使用的形态学表征和表型分析的抗原呈现细胞1,2,3.为了整合成像和分型方法的优点, 我们描述了在单细胞和种群水平的成像分析平台, 以演示在人类树突状细胞 (DCs) 中改变的蛋白质共定位。在多肽抗原表达中, 主要的组织相容复合物 (MHC) I 类分子结合在内质网中的短肽 (8-10 残留物) 激活传统的 CD8+ T 细胞, 而 MHC II 类分子结合一个相对较长的内吞中的肽 (约20个残留物) 激活常规 CD4+ T 细胞1,4。相比之下, 脂质特异性 T 细胞是由 CD1 蛋白激活的, 脂质抗原主要载于内吞夹层5,6。脂质抗原的表现需要提供脂代谢产物在脂质新陈代谢7,8,9,10和负载的功能性脂代谢物 CD1 蛋白质内吞隔间5,6。在这种情况下, 各种细胞因子调节脂质抗原的表现, 特别是在环境暴露的亲脂性污染物和免疫紊乱, 是至关重要的定义。在本研究中, 我们使用转录组分析, 图像分析, 和细胞和种群成像分析的人单核细胞衍生的 DCs, 以确定内吞蛋白的贩运导致在污染物暴露的脂质抗原呈现。当然, 该组合平台可用于研究不同生物过程中亚细胞蛋白的贩运和共定位。
从技术上讲, 亚细胞蛋白的定位通常使用共聚焦显微镜进行演示, 并在数量有限的检测到的细胞1、2、3、11中进行统计分析。此外, 流式细胞仪已广泛应用于细胞12级多蛋白共染色信号的门细胞种群;然而, 这缺乏亚细胞蛋白共定位的详细可视化。为了在细胞和种群水平上实现对蛋白质共定位百分比的综合和统计分析, 我们结合了成像分析和分析方法, 以确定蛋白质共定位的特征与生物关联。具体来说, 我们使用影像流式细胞仪检测 CD1d 和溶酶相关膜蛋白 1 (Lamp1) 蛋白的共定位。增强分子的定量分析以前很难在种群尺度上进行。在这项研究中, 我们调整了 ImageJ-斐济计划, 在种群和个体细胞水平上, 研究大量共染色细胞的蛋白质共定位的百分比。具体而言, 我们测量了共局部面积、强度和种群大小, 以支持结论: CD1d 蛋白主要保留在人类 DCs 的晚期内吞夹层中, 接触到一种亲脂性污染物 (苯并) 芘 (BaP)13.这种结合细胞和人口成像分析提供了高度可重复性, 全面和统计学上显著的结果 CD1d-Lamp1 共定位相关的抑制脂质抗原呈现。
bap 暴露的人类 DCs 的转录组强烈支持内吞脂代谢和 CD1d 内吞贩运在 BaP 暴露中受损的假说。为了测试这个假说, 我们应用影像流式细胞仪来分析与多种蛋白质共染色的 DC 种群的图像, 包括 CD1d、内吞标记和直流标记。最后, 对共染色细胞进行统计分析, 以证明 CD1d 和 Lamp1 共定位的强度和面积的百分比。
Protocol
Representative Results
Discussion
改变基因通路的功能确认是有挑战性的, 因为广泛影响的基因表达涉及多个途径和困难, 以整合个人和种群细胞活动。我们使用影像流式细胞仪专门测试 CD1d 在内吞隔间的贩运。影像流式细胞仪集成了细胞的种群测量和多蛋白亚细胞共定位的个体演示。共聚焦显微镜在测量蛋白质共定位时提供了高分辨率, 流式细胞仪能够为不同的细胞群提供全面的分型。成像流式细胞仪将共聚焦显微镜和流式细胞?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢罗伯特 Giulitto (远见卓识血液中心) 的人血液样本和良牛医生的基因表达的规范化读。我们还感谢国家环境健康科学研究所 (ES006096)、环境遗传学中心 (CEG) 试点项目 (史绍熙)、国家过敏和传染性疾病研究所 (AI115358) (史绍熙) 的赠款支持, 大学辛辛那提大学研究委员会奖 (史绍熙) 和辛辛那提大学医学院核心增强资金 (x.z.)。
Materials
| Transcriptomics | Illumina | HiSeq 2500 v4 | Illumina HiSeq system |
| ImagingStream X | Millipore | 100220 | Imaging flow cytometry |
| mirVana miRNA Isolation Kit | Thermo Fisher | Total RNA extraction | |
| Agilent RNA 6000 Pico Kit | Agilent | Total RNA QC analysis | |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | Thermo Fisher | PCR, enzyme reaction | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England Biolab | PolyA RNA purification | |
| Automated SMARTer Apollo system | Takara | PolyA RNA purification | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolab | Library preparation | |
| Agencourt AMPure XP magnetic beads | Beckman Coulter | DNA purification | |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| Agilent High Sensitivity DNA Kit | Agilent | Library QC, size distribution analysis | |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR System (Thermo Fisher) | Thermo Fisher | Library quantification | |
| NEBNext Library Quant Kit | New England Biolab | Library quantification | |
| cBot | Illumina | Library cluster generation | |
| TruSeq SR Cluster Kit v3 – cBot – HS | Illumina | Library cluster generation | |
| HiSeq 1000 | Illumina | Sequencing | |
| TruSeq SBS Kit v3 – HS (50-cycles) | Illumina | Sequencing | |
| Phycoerythrin/Cyanine 7 (PE/Cy7) | Bio Legend | L243 | |
| Phycoerythrin/Cyanine 5 (PE/Cy5) | Bio Legend | 3.9 | |
| Brilliant violet 421 | Bio Legend | L161 | |
| PE-anti-mouse IgG2b | Bio Legend | 51.1 | |
| Alexa Fluor 647 (AF647) | Bio Legend | CD107a(H4A3) |
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