Ex Vivo Normothermic 간 관류의 작은 동물 모델
Summary
상당한 간 기증자 부족 이며 간 기증자에 대 한 기준을 확대 했습니다. Normothermic ex vivo 간 관류 (NEVLP)를 평가 하 고 장기의 기능을 수정 개발 되었습니다. 이 연구 NEVLP의 쥐 모델을 보여 줍니다 고 간 보존 부상 완화 pegylated catalase의 능력을 테스트 합니다.
Abstract
간 이식의 중요 한 부족, 이식에 사용할 수 있는 이며 응답에서 기증자 기준을 확대 했습니다. 그 결과, normothermic 비보 전 간 관류 (NEVLP)를 평가 하 고 장기의 기능을 수정 하는 방법으로 도입 되었습니다. NEVLP에는 저체온증에 비해 많은 이점이 있다 고 보존 부상, 정상 장기의 기능 생리 조건 평가 기관 성능, 그리고 오르간 수리에 대 한 플랫폼으로의 복원 감소 subnormothermic 관류 등 리 모델링, 그리고 수정. Murine 및 돼지 NEVLP 모델 설명 되었습니다. 우리는 NEVLP의 쥐 모델을 설명 하 고이 모델을 사용 하 여 중요 한 응용 프로그램 중 하나를 보여-치료 분자 간 perfusate에 추가 사용 하 여. 카 탈 라 제 생 반응성 산소 종 (선생님) 폐품 이며 눈, 뇌, 그리고 폐에 국 소 빈 혈 reperfusion 감소 입증 되었습니다. Pegylation은 endothelium에 catalase를 대상으로 표시 되었습니다. 여기, 우리는 기본 perfusate pegylated catalase (못-고양이) 추가 간 보존 상해를 완화 하는 기능을 시연 했다. 우리의 설치류 NEVLP 모델의 장점은 큰 동물 모델에 비해 비싼 아니에요입니다. 이 연구의 한계는 그것은 현재 간 이식 후 관류는 포함 하지 않습니다. 따라서, 확실 하 게 예측 후 장기 이식의 함수를 만들 수 없습니다. 그러나, 쥐 간 이식 모델은 잘 설립 하 고 확실히이 모델과 함께에서 사용 될 수 있습니다. 결론적으로, 우리는 저렴, 간단 하 고, 쉽게 복제 가능한 NEVLP 모델을 쥐를 사용 하 여 설명 했다. 이 모델의 응용 프로그램 테스트 소설 perfusates 및 perfusate 첨가제, 테스트 기관 평가 위한 소프트웨어 및 장기를 복구 하도록 설계 된 실험을 포함할 수 있습니다.
Introduction
14,578 환자 간 이식 대기자 명단에 있으며 약 7000 이식 당 년1,2수행 됩니다. 이 중요 한 기증자 부족에 대응, 간 기증자에 대 한 기준을 확장 했다; 이 종종 한계 장기 또는 확장된 기준 기증자 하며 기본 이식 부전 및 지연된 이식 함수3의 더 높은 속도와 표준 기준 이식 보다 이식 후 덜 잘 수행할 것으로 예상 된다 4,,56. 그 결과, NEVLP 평가 기관 기능6,7을 수정 하는 방법으로 도입 되었습니다. 우리 NEVLP의 쥐 모델을 설계 하 고이 모델을 사용 하는 그것의 중요 한 잠재적인 응용 프로그램-간 perfusate에 비 발한 분자 첨가제의 테스트 중 하나를 보여 줍니다.
NEVLP (쥐) murine 및 돼지 모델 뿐만 아니라 폐기 인간의 장기6,,89평가 하고있다. NEVLP의 첫 인체 실험의 결과 또한 최근 게시10있다. 저체온증이 기계 관류 명확 하 게 신장 보존을 위한 표준 되고있다, 관류는 간 기계에서 발생 하는 온도 여전히 논란. NEVLP는 저체온증에 비해 많은 제안된 이점 및 subnormothermic 관류. 이들은 감소 보전 부상, 정상 장기의 기능 생리 조건, 장기 성능을 평가 하는 능력 및 기관 수리, 개조, 및 수정7,11를 위한 플랫폼으로의 복원 12,13,14,15,,1617.
연구의 상당수 돼지 NEVLP 모델을 사용 하 여 완료 되었습니다. 때 고려 모델을 사용 하 여 삭제 인간 장기 또는 인간 임상 시험이이 모델은 비교적 비싼 되지 않습니다, 하지만 그들은 우리의 작은 동물 NEVLP 모델에 비해 매우 비쌉니다. 중요 한 구성 요소는 실험 당 비용은 perfusate 이다. 우리는 상대적으로 저렴 한 비용에 perfusate의 300 mL와 4 h 관류를 완료할 수 있습니다. 또한, 쥐를 포함 하 여 작은 동물의 비용 돼지의 비용에 비해 매우 낮습니다.
쥐에서 NEVLP의 다른 모델에 비해 여기 모델 구현에 상대적으로 간단한 이며 광범위 한 응용 프로그램 있다. 관류 회로 그림 1에서 볼 수 있습니다. perfusate perfusate 저수지 (1), 물 외피 컨테이너에서 시작 합니다. Perfusate 롤러 펌프 (2) 저수지에서 가져온 이며 windkessel (3) 그리고 oxygenator (4)에 밀어. oxygenator 최대 가스 교환을 제공 역류 가스 및 perfusate 흐름에 대 한 설정 됩니다. Perfusate 다음 수익금으로 난방 코일 (5) 내부 생리 온도에, 그것을 보장 하기 위해 관류 챔버는 그리고 거기 공기 방울의 관류를 방지 하기 위해 거품 트랩 (6) 사전 (7) 및 후 기관 (8) 수를 perfusate 수 있는 샘플 포트 샘플링. perfusate 다음 문맥 정 맥을 통해 간을 입력합니다. 문맥 정 맥 압력 모니터 데이터 수집 소프트웨어에 있는 값을 차트에 첨부 됩니다. perfusate IVC 정 맥을 통해 간 종료 그리고 압력 이퀄라이저 블록 (9)으로 흐른다. 마지막으로, perfusate는 롤러 펌프를 통해 다시 압력 블록에서 가져온 이며 저수지에 비운. 이 모델 포함 하는 문맥에 지속적인 관류 및 간 동맥 및 투 석 다른 모델에 사용 되는 별도 고 추가 회로 필요, 타악기 흐름 밖으로 나뭇잎 하지만 이전 하지 입증 되었습니다. 필요한9,13.
perfusate에 새로운 치료 분자의 추가 탐험, 우리 효소 카 탈 라 제를 선택 했다. 카 탈 라 제는 생 선생님 폐품 선생님18의 효과 완화 하는 셀 내부 방어 메커니즘의 일부입니다. 카 탈 라 제 식 간 국 소 빈 혈 reperfusion 상해19에서 증가 된다. Catalase의 실험 또한 눈, 뇌, 그리고 폐20,,2122,,2324에 국 소 빈 혈 reperfusion 감소 입증 되었습니다. Pegylation 내 피 세포25에 피 catalase 이해에 원조 하는 catalase를 대상으로 표시 되었습니다. 못-고양이 되어 관리 체계적으로 간 국 소 빈 혈 reperfusion 상해; 감소에 제한 된 효능 그러나, 우리는26,,2728결과 추가 말뚝-고양이 격리 된 장기 관류 회로 개선 이어질 것을 가정 했다. 여기, 우리가 우리의 기본 perfusate 말뚝-고양이 추가 및 그것의 능력을 간 보존 부상 완화.
Protocol
Representative Results
Discussion
이식에 사용할 수 있는 간 이식의 중요 한 부족은 그리고 응답에 기증자 기준 확장된1,2,3,,45되었습니다. 기증자 부족 결과로 NEVLP 평가 기관 기능6,7을 수정 하는 방법으로 도입 되었습니다. 우리는 NEVLP의 쥐 모델을 설계 했습니다. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 장기 이식, 관류, 엔지니어링 및 오하이오 주립 대학에서 재생에 대 한 NIH T32AI 106704-01A1와 토니 flesch 식 기금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Perfusate | |||
| 8% Albumin | CLS Behring, King of Prussia, PA | 0053-7680-32 | |
| Williams Media | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | W1878 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | P4333 | |
| Insulin | Eli Lilly, Indianapolis, IL | 0002-8215-91 | |
| Heparin | Fresnius Lab, Lake Zurich, IL | C504701 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | G3126 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | H0888 | |
| THAM | Hospira, Inc, | 0409-1593-04 | |
| Polyethylene Glycol – Catalase | Sigma Aldrich | S9549 SIGMA | |
| Personal Protective Equipment | |||
| Surgical Mask | Generic | N/A | |
| Protective Gown | Generic | N/A | |
| Surgical Gloves | Generic | N/A | |
| Liver Procurement | |||
| Sprague-Dawley Rat | Harlan Sprague Dawley Inc. | 250 -350 grams | |
| Surgical Microscope | Leica | M500-N w/ OHS | |
| Charcoal Canisters | Kent Scientific | SOMNO-2001-8 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare | N/A | |
| Pressure-Lok Precision Analytical Syringe | Valco Instruments Co, Inc. | SOMNO-10ML | |
| Electrosurgical Unit | Macan | MV-7A | |
| Warming Pad | Braintree Scientific | HHP2 | |
| SomnoSuite Small Animal Anesthesia System | Kent Scientific | SS-MVG-Module | |
| PhysioSuite | Kent Scientific | PS-MSTAT-RT | |
| Isoflurane chamber | Kent Scientific | SOMNO-0530LG | |
| SurgiVet | Isotec | CDS 9000 Tabletop | |
| Oxygen | Praxair | 98015 | |
| Rib retractors | Kent Scientific | INS600240 | |
| GenieTouch | Kent Scientific | GenieTouch | |
| Normal Saline | Baxter | NDC 0338-0048-04 | |
| 4×4 Non-Woven Sponges | Criterion | 104-2411 | |
| Sterile Q-Tips | Henry Schein Animal Health | 1009175 | |
| U-100 27 Gauge Insulin Syringe | Terumo | 22-272328 | |
| 5mL Syringe | BD | REF 309603 | |
| 4-0 Braided Silk Suture | Deknatel, Inc. | 198737LP | |
| 7-0 Braided Silk Suture | Teleflex Medical | REF 103-S | |
| 16 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4252586-02 | |
| 14 gauge Catheters | BBraun Introcan Safety | 4251717-02 | |
| Bile Duct Cannular Tubing | Altec | 01-96-1727 | |
| Liver Perfusion Circuit Components | |||
| Water Bath Warmer | Lauda Ecoline Staredition | E103 | |
| Data Collection Software | ADInstruments | Labchart 7 | |
| Liver Perfusion Circuit | Harvard Apparatus | 73-2901 | |
| Membrane Oxygenator | Mediac SPA | M03069 | |
| Roller Pump | Ismatec | ISM827B | |
| Gas (95% oxygen and 5% carbon dioxide) | Praxair | 98015 | |
| Organ Chamber | Harvard Apparatus | ILP-2 | |
| 1.8 mL Arcticle Cryogenic Tube | USA Scientific | 1418-7410 | |
| Mucasol | Sigma-Aldrich | Z637181 | |
| Microsurgical Instruments | |||
| Small Scissors | Roboz | RS-5610 | |
| Large Scissors | S&T | SAA-15 | |
| Forceps – Large Angled | S&T | JFCL-7 | |
| Forceps – Small Angled | S&T | FRAS-15 RM-8 | |
| Clip Applier | ROBOZ | RS-5440 | |
| Scissors – non micro | FST 14958-11 | 14958-11 | |
| Forceps – Straight Tip | S&T | FRS-15 RM8TC | |
| Large Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-01 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-02 | |
| Small Microsurgical Clip | Fine Scientific Tools | 18055-03 | |
| Small Mosquito Clamps | Generic | N/A | |
| Post-Experiment Analysis | |||
| Alanine Aminotransferase (ALT) Activity Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K752 | |
| Adenosine Triphosphate (ATP) Colorimetric/Fluorometric Assay Kit | BioVision | K354 | |
| Glutathione Assay Kit | Cayman Chemical | 703002 | |
| Lipid Peroxidation (MDA) Assay Kit | Abcam | ab118970 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8090 | |
| POLARstar OMEGA Microplate Reader | BMG LABTECH | N/A |
Referências
- . National Data. Overall by Organ. Current U.S. Waiting List. Based on OPTN data as of October 19, 2017 Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/ (2017)
- . National Data, Transplants by Donor Type, U.S. Transplants Performed January 1, 1988 – December 31, 2016, For Organ = Liver Available from: https://optn.transplant.hrsa.gov/data/view-data-reports/national-data/ (2017)
- Nemes, B., et al. Extended criteria donors in liver transplantation Part I: reviewing the impact of determining factors. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 827-839 (2016).
- Nemes, B., et al. Extended-criteria donors in liver transplantation Part II: reviewing the impact of extended-criteria donors on the complications and outcomes of liver transplantation. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 841-859 (2016).
- Pezzati, D., Ghinolfi, D., De Simone, P., Balzano, E., Filipponi, F. Strategies to optimize the use of marginal donors in liver transplantation. World J Hepatol. 7 (26), 2636-2647 (2015).
- Marecki, H., et al. Liver ex situ machine perfusion preservation: A review of the methodology and results of large animal studies and clinical trials. Liver Transpl. 23 (5), 679-695 (2017).
- Barbas, A. S., Knechtle, S. J. Expanding the Donor Pool With Normothermic Ex Vivo Liver Perfusion: The Future Is Now. Am J Transplant. 16 (11), 3075-3076 (2016).
- Dries, S., et al. Ex vivo normothermic machine perfusion and viability testing of discarded human donor livers. Am J Transplant. 13 (5), 1327-1335 (2013).
- Westerkamp, A. C., et al. End-ischemic machine perfusion reduces bile duct injury in donation after circulatory death rat donor livers independent of the machine perfusion temperature. Liver Transpl. 21 (10), 1300-1311 (2015).
- Selzner, M., et al. Normothermic ex vivo liver perfusion using steen solution as perfusate for human liver transplantation: First North American results. Liver Transpl. 22 (11), 1501-1508 (2016).
- Whitson, B. A., Black, S. M. Organ assessment and repair centers: The future of transplantation is near. World J Transplant. 4 (2), 40-42 (2014).
- Tolboom, H., et al. Subnormothermic machine perfusion at both 20°C and 30°C recovers ischemic rat livers for successful transplantation. J Surg Res. 175 (1), 149-156 (2012).
- Nagrath, D., et al. Metabolic preconditioning of donor organs: defatting fatty livers by normothermic perfusion ex vivo. Metab Eng. 11 (4-5), 274-283 (2009).
- Boehnert, M. U., et al. Normothermic acellular ex vivo liver perfusion reduces liver and bile duct injury of pig livers retrieved after cardiac death. Am J Transplant. 13 (6), 1441-1449 (2013).
- Schön, M. R., et al. Liver transplantation after organ preservation with normothermic extracorporeal perfusion. Ann Surg. 233 (1), 114-123 (2001).
- Reddy, S., et al. Non-heart-beating donor porcine livers: the adverse effect of cooling. Liver Transpl. 11 (1), 35-38 (2005).
- Banan, B., et al. Novel strategy to decrease reperfusion injuries and improve function of cold-preserved livers using normothermic ex vivo liver perfusion machine. Liver Transpl. 22 (3), 333-343 (2016).
- Held, P. . An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in Cells. , 1-14 (2012).
- Chen, C. F., et al. Reperfusion liver injury-induced superoxide dismutase and catalase expressions and the protective effects of N-acetyl cysteine. Transplant Proc. 39 (4), 858-860 (2007).
- Chen, B., Tang, L. Protective effects of catalase on retinal ischemia/reperfusion injury in rats. Exp Eye Res. 93 (5), 599-606 (2011).
- He, Y. Y., Hsu, C. Y., Ezrin, A. M., Miller, M. S. Polyethylene glycol-conjugated superoxide dismutase in focal cerebral ischemia-reperfusion. Am J Physiol. 265 (1 Pt 2), H252-H256 (1993).
- Işlekel, S., Işlekel, H., Güner, G., Ozdamar, N. Alterations in superoxide dismutase, glutathione peroxidase and catalase activities in experimental cerebral ischemia-reperfusion. Res Exp Med (Berl). 199 (3), 167-176 (1999).
- Li, G., Chen, Y., Saari, J. T., Kang, Y. J. Catalase-overexpressing transgenic mouse heart is resistant to ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol. 273 (3 Pt 2), H1090-H1095 (1997).
- Nowak, K., et al. Immunotargeting of catalase to lung endothelium via anti-angiotensin-converting enzyme antibodies attenuates ischemia-reperfusion injury of the lung in vivo. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 293 (1), L162-L169 (2007).
- Beckman, J. S., et al. Superoxide dismutase and catalase conjugated to polyethylene glycol increases endothelial enzyme activity and oxidant resistance. J Biol Chem. 263 (14), 6884-6892 (1988).
- Yabe, Y., Nishikawa, M., Tamada, A., Takakura, Y., Hashida, M. Targeted delivery and improved therapeutic potential of catalase by chemical modification: combination with superoxide dismutase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 289 (2), 1176-1184 (1999).
- Yabe, Y., et al. Prevention of neutrophil-mediated hepatic ischemia/reperfusion injury by superoxide dismutase and catalase derivatives. J Pharmacol Exp Ther. 298 (3), 894-899 (2001).
- Ushitora, M., et al. Prevention of hepatic ischemia-reperfusion injury by pre-administration of catalase-expressing adenovirus vectors. J Control Release. 142 (3), 431-437 (2010).
- Kakizaki, Y., et al. The Effects of Short-Term Subnormothermic Perfusion after Cold Preservation on Liver Grafts from Donors after Cardiac Death: An Ex Vivo Rat Model. Transplantation. , (2018).
- Kumar, R., Chung, W. Y., Dennison, A. R., Garcea, G. Ex Vivo Porcine Organ Perfusion Models as a Suitable Platform for Translational Transplant Research. Artif Organs. , (2017).
- Nativ, N. I., et al. Liver defatting: an alternative approach to enable steatotic liver transplantation. Am J Transplant. 12 (12), 3176-3183 (2012).
- Yeung, J. C., et al. Ex vivo adenoviral vector gene delivery results in decreased vector-associated inflammation pre- and post-lung transplantation in the pig. Mol Ther. 20 (6), 1204-1211 (2012).
- Goldaracena, N., et al. Inducing Hepatitis C Virus Resistance After Pig Liver Transplantation-A Proof of Concept of Liver Graft Modification Using Warm Ex Vivo Perfusion. Am J Transplant. 17 (4), 970-978 (2017).
- Van Raemdonck, D., Neyrinck, A., Rega, F., Devos, T., Pirenne, J. Machine perfusion in organ transplantation: a tool for ex vivo graft conditioning with mesenchymal stem cells?. Curr Opin Organ Transplant. 18 (1), 24-33 (2013).
- Pratschke, S., et al. Results of the TOP Study: Prospectively Randomized Multicenter Trial of an Ex Vivo Tacrolimus Rinse Before Transplantation in EDC Livers. Transplant Direct. 2 (6), e76 (2016).
- Pratschke, S., et al. Protocol TOP-Study (tacrolimus organ perfusion): a prospective randomized multicenter trial to reduce ischemia reperfusion injury in transplantation of marginal liver grafts with an ex vivo tacrolimus perfusion. Transplant Res. 2 (1), 3 (2013).
- Nativ, N. I., et al. Elevated sensitivity of macrosteatotic hepatocytes to hypoxia/reoxygenation stress is reversed by a novel defatting protocol. Liver Transpl. 20 (8), 1000-1011 (2014).
- Lonze, B. E., et al. In vitro and ex vivo delivery of short hairpin RNAs for control of hepatitis C viral transcript expression. Arch Surg. 147 (4), 384-387 (2012).
