Artigo de método

Isolamento de Fima rápida e específica de oligodendrócitos primário de Mouse

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DOI:

10.3791/57543

⸱

21 de maio de 2018

 ,  , 
1Program in Molecular and Cellular Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 2Department of Neurology and Rehabilitation, University of Illinois at Chicago

Neste artigo

Resumo

Descrevemos o isolamento de Fima de oligodendrócitos mouse principal, que permite o isolamento das células para cultura em vitro rápido e específico.

Resumo

O isolamento eficiente e robusto e a cultura de oligodendrócitos primários (OLs) é uma ferramenta valiosa para o estudo em vitro de desenvolvimento de oligodendróglias, bem como a biologia do desmielinizantes doenças como a esclerose múltipla e Doença de Pelizaeus-Merzbacher-como (PMLD). Aqui, apresentamos um simples e método de seleção eficiente para o isolamento de Fima da fase três O4+ preoligodendrocytes as células de filhotes de ratos neonatal. Desde que o imaturo OL constituem mais de 80% da matéria branca de cérebro de roedor no 7º dia pós-natal (P7) este método de isolamento não só garante alto rendimento celular, mas também o isolamento específico de OLs já se comprometeu a linhagem oligodendroglial, diminuindo o possibilidade de isolar células contaminantes como astrócitos e outras células do cérebro do rato. Este método é uma modificação das técnicas relatado anteriormente e fornece a pureza de preparação oligodendrocyte acima de 80% em cerca de 4 h.

Introdução

Oligodendrócitos (OLs) são células do sistema nervoso central (SNC)1microambiental. O isolamento e a cultura de oligodendrócitos primários em um ambiente fortemente regulamentado é uma ferramenta valiosa para o estudo em vitro de desenvolvimento de oligodendróglias, bem como a biologia do desmielinizantes doenças como a esclerose múltipla2 . Isso requer um eficiente e robusto oligodendrocyte isolamento e cultura método3. Neste estudo, aproveitamos a expressão de um marcador de superfície de célula oligodendrocyte distintivo para implementar uma técnica de isolamento modificado que é rápida e específica.

Identificaram-se quatro fases distintas de maturação oligodendrocyte, cada um caracterizado pela expressão de marcadores de superfície celular distinto para cada estágio do desenvolvimento (Figura 1). Estes marcadores de superfície celular podem ser reconhecidos por anticorpos específicos4,5e podem ser usados para isolar OLs em estágios específicos. Na primeira fase, as células precursoras de oligodendrocyte (OPCs) têm a capacidade de proliferar, migrar e especificamente expresso de fator de crescimento derivado de plaquetas do receptor (PDGF-Rα)6, gangliosídeos A2B5 proteoglycan NG27,8 , polysialic ácido-neural celular adesão molécula9 e graxos-ácido-proteína obrigatória 7 (FABP7)10. OPCs têm morfologia bipolar com alguns processos curtos emanando os polos opostos do corpo celular, que é característica de células precursoras neurais11.

Diagrama de maturação de oligodendrócitos; estágios com marcadores: OPC, Pré-oligodendrócito, Imaturo, Maduro.
Figura 1: expressão de marcadores de superfície celular durante o desenvolvimento do oligodendrocyte rato. OLs célula marcadores de superfície tais como A2B5 GalC (O1), NG2, O4 e PDGF-Rα podem ser usado para isolar especificamente oligodendrócitos no estágio de desenvolvimento específico usando anticorpos específicos.   Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Na segunda etapa, OPCs dão origem a preoligodendrocytes em expresso na membrana da célula não apenas marcadores OPC, mas também o sulfatide (um galactolipid sulfatado) reconhecido pelo anticorpo O412,13e a proteína GPR1714, que persiste até o estágio imaturo oligodendrocyte (OL). Nesta fase, preoligodendrocytes estender processos curtos multipolares. Preoligodendrocytes são o grande palco OL em dia pós-Natal 2 (P2) na substância branca cerebral, do rato e do rato com uma pequena população de imaturos OLs15.

Durante a terceira fase, OLs imaturos continuam a expressar O4, perder a expressão de marcadores A2B5 e NG2 e expressar galactocerebroside C16. Nesta fase, OLs estão empenhados a linhagem oligodendroglial e tornar-se células pós mitóticas com ramos muito ramificado17,18. OL imaturo constituem mais de 80% da matéria branca roedor no P7... e neste momento as primeiras células MBP+ são observadas15,19,20,21. Portanto, o isolamento de OLs no P7 poderia garantir celulares de alto rendimento.

Na quarta e última fase de desenvolvimento de OL, maduros OLs expressam microambiental proteínas (proteína básica da mielina (MBP), proteína proteolipid (PLP), glicoproteína mielina associada (MAG) e mielina oligodendrocyte glicoproteína (MOG)22,23 ,24,25,26. Nesta fase, maduros OLs estendem as membranas que compacta de forma enwrapping bainhas em torno dos axônios e são capazes de myelinate. Isso coincide com a observação de que, no cérebro do rato e do rato, MBP+ células tornam-se cada vez mais abundantes em P1419,20,21.

Desde o primeiro isolamento do oligodendrocyte por Fewster e colegas em 196727, foram implementados diversos métodos para isolamento de OLs o roedor CNS incluindo immunopanning28,29,30, fluorescência-ativado da pilha de classificação (FACS) explorando a célula antígenos de superfície específicos28,31, centrifugação gradiente diferencial32,33,34,35 e agitação método baseado na aderência diferencial de diferentes CNS glia36,37. No entanto, os métodos de cultura existentes têm limitações, particularmente em termos de pureza, rendimento e tempo necessário para executar os procedimentos de38. Portanto, mais eficientes métodos de isolamento de oligodendrócitos são necessários.

Neste trabalho, apresentamos um simples e método de seleção eficiente para o isolamento de Fima da fase três O4+ preoligodendrocytes as células de filhotes de ratos neonatal. Este método é uma modificação das técnicas relatado por Emery et al 39 e Dincman et al . 40 e fornece uma pureza de preparação do oligodendrocyte acima de 80% em cerca de 4 h.

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Protocolo

Os ratos utilizados neste estudo foram tratados de acordo com as diretrizes do número de protocolo de SUNY Downstate Medical Center divisão de laboratório Animal recursos (DLAR) 15-10492.

Nota: Oligodendrócitos primários foram isolados de neonatal (P5-P7 selvagem-tipo C57Bl/6N) ratos. Nesta fase, o imaturos OLs constituem mais de 80% da matéria branca roedor, garantindo alto rendimento celular. Todo buffer e composições de reagente estão disponíveis no final da Tabela de materiais.

1. preparação lamelas

Nota: Poli-D-lisina (PDL) / lamelas laminina revestida devem ser preparadas antes do isolamento de OL.

  1. Lugar #1 alemão lamelas de vidro em um tubo cónico de 50 mL e adicionar 35 mL de 70% EtOH para limpá-los.
  2. Fechar o tubo, coloque-o em um misturador de oscilador e incubar a temperatura ambiente pelo menos 30 min enquanto balançando suavemente. As lamelas podem ser incubadas durante a noite.
  3. Descarte o EtOH 70%.
  4. Lave as lamelas 3 vezes com água desionizada, remover a água com vácuo aspiração sempre.
  5. Adicione 30-35 mL de PDL 50 µ g/mL para as lamelas do tubo de 50 mL, suficiente para cobrir as lamelas.
  6. Coloque o tubo de 50 mL contendo as lamelas em um misturador de oscilador e incubar a temperatura ambiente pelo menos 30 min enquanto balançando suavemente.
  7. Lave as lamelas 3 vezes com água desionizada, removendo a água cada vez com vácuo aspiração.
  8. Transferi as lamelas em 60mm placas de Petri contendo água desionizada.
  9. Use uma ponta de pipeta P200 para organizar as lamelas como uma camada cobrindo toda a superfície da caixa de Petri.
  10. Cuidadosamente, remova os pratos com vácuo aspiração da água.
  11. Remova o excesso de água em torno de lamelas e deixe-os secar durante a noite, com a tampa aberta e sob a luz do bairro UV.
    Nota: As lamelas de vidro revestido de PDL podem ser armazenadas a 4 ° C em placas de Petri estéreis por até três meses.
  12. Lugar de lamelas em placas de 24-bem, uma por bem, usando a pinça fina.
  13. Mova as lamelas para o centro do bem fazer com que as bordas não tocar a parede do poço.
  14. Adicione 100 µ l de 10 µ g/mL laminina diluído em B27NBMA (ver a Tabela de materiais) começando no centro de cada lamela e movendo-se em uma forma circular para as bordas para cobrir toda a área.
    Nota: Desde laminina está envolvida na manutenção OL e promove a diferenciação em OLs maduros, é um importante fator de sobrevivência de OL para em vitro cultura41,42,,43,.44.
  15. Incube a placa em uma incubadora de 37 ° C em 5% de CO2 pelo menos 1 h ou até as OLs estão prontos para o chapeamento.

2. Mouse dissociação de córtex cerebral

  1. Sacrifique pós-natal filhotes de rato C57Bl/6N velhos 5-7 dias por decapitação rápida com uma tesoura previamente limpada em etanol a 70%.
    Nota: córtices Cerebral de 5-6 filhotes de ratos neonatal foram utilizados para cada preparação. Em média, um cérebro de rato rende 1-1.5 x 106 OLs.
  2. Cortar a pele do couro cabeludo ao longo da linha mediana com tesouras pequenas de dissecação e retrair para expor a caveira.
  3. Corte o crânio cuidadosamente ao longo da linha mediana a partir da abertura na parte de trás do crânio em direção a área frontal, levantando-a com a tesoura para não danificar o cérebro. Em seguida, usando a abertura na parte de trás do crânio corte para cada soquete do olho ao longo da base do crânio.
  4. Use a pinça fina suavemente arreliar os córtices longe do mesencéfalo e transferi-los para um prato de cultura de tecidos de 60mm contendo 7 mL de B27NBMA. Repita as etapas 2.2 através de 2.4 para cada cérebro, reunindo os córtices dissecados.
  5. Transferir os córtices para um prato de cultura de tecidos de 60mm novo contendo 5 mL de tampão de dissociação (B27NBMA, 20-30 U/mL papaína e 2.500 U DNase eu).
  6. Os córtices com dados em pedaços pequenos, de cerca de 1 mm3 usando uma lâmina de bisturi 15 # e incubar durante 20 min em um 37 ° C, 5% CO2 incubadora.
  7. Adicione 1 mL de soro de crescimento bovino (BGS) para parar a reação enzimática.
  8. Transferi os córtices juntamente com os meios de comunicação de dissociação para um tubo cônico de 15 mL, usando uma pipeta sorológica 10ml.
  9. Delicadamente começa a dissociar o tecido cerebral pipetando lentamente acima e para baixo, 6 - 8 vezes usando uma pipeta de 10 mL serológica, usando cuidado para minimizar as bolhas.
  10. Permitir que os pedaços de tecido de contentar com 2-3 min e transferir o sobrenadante para um tubo de fresco.
  11. Adicionar 3 mL de B27NBMA contendo 10% BGS/2500 U DNase eu no tecido da pelota.
  12. Usar uma pipeta sorológica 5ml para dissociar suavemente o tecido cerebral durante a pipetagem para cima e para baixo 6 - 8 vezes. Tenha cuidado para minimizar as bolhas.
  13. Permitir que os pedaços de tecido de contentar com 2-3 min.
  14. Transferi o sobrenadante para um tubo de fresco. Adicionar 3 mL de B27NBMA contendo 10% BGS/DNase eu no tecido da pelota.
  15. Delicadamente, dissociar o tecido cerebral usando a ponta da pipeta P1000, enquanto pipetagem o mix de mídia e tecido do cérebro acima e para baixo. Repita as etapas 2.13 e 2.14 até permanecem sem grandes pedaços de tecido ou até B27NBMA contendo 10% BGS/DNase, está esgotado, o que vier primeiro. Tenha cuidado para minimizar as bolhas.
  16. Suspensão de células de piscina com sobrenadantes anteriores.
  17. Coloque o filtro de célula de 70 µm em um tubo de 50 mL. Usando uma pipeta de 10 mL serológica, passe a suspensão de eritrócitos em pool suavemente sobre o filtro de célula de 70 µm.
  18. Lavar o filtro célula adicionando 1 mL de B27NBMA contendo 10% BGS/DNase eu.
  19. Descarte o filtro da célula. Trazer o volume de 30 mL com B27NBMA contendo 10% BGS/DNase eu.
  20. Transferi a suspensão de eritrócitos para dois tubos cônicos de 15 mL. Centrifugar a suspensão de eritrócitos durante 10 minutos a 200 g de x.
  21. Remova o sobrenadante sem deixar as células expostas ao ar. O sobrenadante será nublado devido a detritos celulares. Adicionar 3 mL de B27NBMA contendo 10% BGS para a pelota.
  22. Cuidadosamente se dissociam o centrifugado usando uma pipeta P1000. Trazer o volume para 15 mL com B27NBMA contendo 10% BGS.
  23. Passe um coador de célula fresco 40 µm, a suspensão de eritrócitos.
  24. Lavar o filtro célula adicionando 1mL de B27NBMA contendo 10% BGS. Descarte o filtro da célula.
  25. Trazer o volume de 30 mL com B27NBMA contendo 10% BGS.
  26. Transferi a suspensão de eritrócitos para tubos cônicos de 2 x 15 mL. Centrifugar a suspensão de eritrócitos durante 10 minutos a 200 g de x.
  27. Remova a maioria do líquido sobrenadante sem deixar as células expostas ao ar. Resuspenda as pelotas de célula em 5 mL de célula de magnético frio gelo, classificando o tampão (MCS).

3. a determinação da contagem de células e viabilidade

  1. Dilua 100 µ l de suspensão de células com 400 µ l de solução de azul de Tripan em um tubo de 1,5 mL microcentrifuga para obter uma diluição de 1:5 em 0,4% (p/v).
  2. Centralize um vidro de tampa sobre uma câmara de hemocytometer e preencher as duas câmaras com 10 µ l da diluição celular usando uma pipeta de P10 e evitando encher em demasia. A solução passará sob o tampa de vidro por ação capilar.
  3. Coloque o hemocytometer na fase de microscópio e ajustar o foco usando 40 ampliação de X.
    Nota: A contagem de células é registradas usando um contador à mão em cada um dos cinco quadrados (quatro cantos e um centro). Apenas as células não-viáveis absorvem o corante e aparecem em azuis, enquanto vivo e células saudáveis aparecem redondos e refração e não absorvem o corante de cor azul, permitindo a determinação do número de células viáveis e totais por mililitro.

4. isolamento de O4+ oligodendrócitos

  1. Centrifugar a suspensão de célula 200 x g durante 10 minutos.
  2. Cuidadosamente, desprezar o sobrenadante usando vácuo aspiração, evitando a exposição das células ao ar.
  3. Resuspenda o pellet em 90 µ l de tampão MCS por 1 x 107 células total seguido pela adição de 10 µ l de anti-O4 grânulos por 1 x 107 células.
  4. Misture a suspensão de células e grânulos suavemente, passando rapidamente o tubo cônico de 15 mL, com o dedo 4 - 5 vezes.
  5. Incubar a mistura por 15 min a 4 ° C, passando rapidamente o tubo cônico de 15 mL, com o dedo 4-5 timesevery 5 min.
  6. Lave a mistura delicadamente adicionando 2 mL de tampão MCS por 1 x 107 células ao tubo. Centrifugue a mistura em 200 x g durante 10 minutos.
  7. Desprezar o sobrenadante, cuidadosamente usando vácuo aspiração, evitando a exposição das células ao ar. Ressuspender as células em 500 µ l de tampão MCS para cada 1 x 107 células.
  8. Anexe um separador magnético para um stand de separador magnético. Anexar uma coluna de seleção para o separador magnético e coloque um coador de célula de 40 µm em cima da coluna. Coloque dois 15 mL ou um tubo cónico de 50 mL abaixo da coluna de separação para coletar o fluxo através de.
  9. Pré-enxágue a coluna 40 µm de filtro e separação de célula com 3 mL de tampão MCS e deixe o buffer através da coluna sem deixá-lo secar.
  10. Adicione a mistura de suspensão de células e grânulos para o filtro de célula e na coluna de seleção.
  11. Lave o filtro de célula 40 µm com 1 mL de tampão MCS.
  12. Descartar o filtro célula e deixe a mistura de células, grânulos e buffer de correr através da coluna sem deixá-lo secar.
  13. Lave a coluna de separação 3 vezes com 3 mL de tampão MCS e 1 vez com mídia de proliferação de OL.
  14. Remover a coluna de separação do separador magnético, rapidamente, coloque-o em um tubo cônico de 15 mL e imediatamente adicionar 5 mL de mídia de proliferação de OL.
  15. Coloque um êmbolo na parte superior da coluna e firme impulso para expulsar as pilhas etiquetadas no tubo cônico de 15 mL.
  16. Remova 100 µ l de suspensão de células para determinar a contagem de células e viabilidade usando Trypan azul e hemocytometer, conforme indicado no ponto 3.
    Nota: Viabilidade celular acima de 80% é considerada aceitável para prosseguir com a cultura de OLs, mas viabilidade maior que 90% é o ideal.

5. chapeamento de O4 isolado+ oligodendrócitos

  1. Diluir a suspensão de células para o desejo do chapeamento a densidade (5 x 105 células por lamela) usando a mídia de proliferação de OL.
    Nota: OL densidade de semeadura é muito importante, então a densidade de célula apropriada deve ser confirmada usando um microscópio de cultura do tecido antes de prosseguir. Semeando a densidade abaixo de 10.000 células/lamelas pode levar a sobrevivência da pilha pobre. No chapeamento de densidade de 10.000 a 25.000, OL diferenciação morfológica é lenta45. Nós da placa OLs em uma densidade de semeadura de no mínimo 50.000 células/lamelas para garantir a sobrevivência da pilha.
  2. Mova as placas de 24 poços contendo lamelas revestidas com laminina da incubadora para o bairro de cultura de tecidos.
  3. Remova cada lamela laminina e substituí-lo com 100 µ l de suspensão OL.
  4. Incube OLs em 37 °C/5% CO2 incubadora para um máximo de 45 min para promover a adesão OL para as lamelas.
  5. Após a incubação, remova as placas de 24 poços da incubadora. Inundar-nos bem da placa de 24 poços com 500 µ l de mídia de proliferação de OL.
  6. Coloque os OLs em 37 °C/5% CO2 incubadora para adicional 24h.
  7. 24 h após o chapeamento de OLs, remova a mídia de proliferação e substituir com mídia de diferenciação OL para induzir a diferenciação.
  8. Coloque os OLs volta na incubadora e não remova até que as células estão prontas para fixação.
    Nota: Mudanças no pH são prejudicial para OLs e diminuir a viabilidade celular, portanto a remoção desnecessária de OLs culturas da incubadora deve ser evitada.

6. mancha da imunofluorescência

  1. Para a detecção de células marcadores de superfície (NG2, O1 e O4) Remova a mídia dos poços.
  2. Adicionar 250 µ l de sobrenadantes de hibridoma rato contendo anticorpos primários O1 (sem diluir)13 e O4 (sem diluir)13 e policlonais contra NG2 de coelho (1:150 diluído em B27NBMA).
    Nota: Se os anticorpos anti-O1 e anti-O4 comercialmente disponíveis devem ser utilizados, é aconselhável utilizar diluições sugeridas pelo fabricante.
  3. Incube as celulas com anticorpo primário por 45 min máximo numa incubadora 37 °C/5% CO2 .
  4. Lave duas vezes com 0,05% Tween-20/1 X PBS. Consertar as células com paraformaldeído 4% (4% PFA) por 10 min à temperatura ambiente.
  5. Lavar três vezes por 5 min cada com 0,05% Tween-20/1 X PBS.
  6. Dilua anti-rato cabra Alexa 488-conjugado IgM ou anti-coelho IgG anticorpo secundário (1: 400) em B27NBMA.
  7. Remova a 0,05% Tween-20/1 X PBS as lamelas. Incube as celulas com anticorpo secundário por 1h à temperatura ambiente no escuro.
  8. Lavar três vezes por 5 min cada com 0,05% Tween-20/1 X PBS.
  9. Para a dupla coloração para a detecção de marcadores internos (GFAP), remova as células 0,05% de Tween-20/1 X PBS e bloco/permeabilize com buffer de bloco/permeabilização durante 15 minutos à temperatura ambiente. Caso contrário, prossiga para a etapa 6.17.
  10. Retire o tampão do bloco/permeabilizacao e adicionar 250 µ l frango anti-GFAP (1: 100) diluído em tampão de bloco/permeabilização.
  11. Incube as celulas com anti-GFAP por 1h à temperatura ambiente. Lavar três vezes por 5 min cada com 0,05% Tween-20/1 X PBS.
  12. Dilua a cabra Alexa 594-conjugados anti-frango IgG anticorpo secundário (1: 400) em B27NBMA.
  13. Remova a 0,05% Tween-20/1 X PBS as lamelas. Incube as celulas com anticorpo secundário por 1h à temperatura ambiente no escuro.
  14. Lavar três vezes por 5 min cada com 0,05% Tween-20/1 X PBS.
  15. Counterstain com 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e montar as células com media mídia contendo DAPI de montagem.
  16. Deixe as lamelas curar durante a noite, no escuro à temperatura ambiente.
  17. Imagem das células coradas com um microscópio de epifluorescência.
    Nota: No presente protocolo, as células foram fotografadas na ampliação de X 40 usando um tempo de exposição uniforme.

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Resultados

O objetivo deste estudo foi estabelecer um método de isolamento melhorada para O4+ oligodendrócitos mouse principal, exigindo a mínimo possível manipulação das células alvo. Todo o procedimento de eutanásia dos filhotes para chapeamento das células em lamelas leva cerca de 4 h e dados mostrados aqui representam três experimentos independentes. Após a dissociação do tecido, uma média de 4,3 ± 0,46 x 107 células foram isolados para cada experimento independente, com um...

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Discussão

Nesta comunicação, apresentamos um método para a isolação eficiente das culturas do oligodendrocyte altamente purificada rato imaturo. Comparado com protocolos previamente publicados39,40, esse método resultou em uma maior pureza com um nível muito inferior de astrócitos GFAP positivo e uma percentagem muito baixa de outras células não-caracterizada. É importante salientar que estas são imaturos OLs já se comprometeu a linhagem oligodendroglial. Assim, estas célu...

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Divulgações

Os autores têm sem divulgações.

Agradecimentos

Este estudo foi suportado por doações da sociedade nacional de esclerose múltipla (RG4591A1/2) e o National Institutes of Health (R03NS06740402). Os autores agradecer Dr. Ivan Hernandez e os seus membros de laboratório para fornecer conselhos, equipamentos e espaço de laboratório.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Pipetas sorológicas de 10mlSeringa13-676-10J
Ponta Luer-LocBD, Becton Dickinson309604
Tubos cônicos de 15mlFalcon352097
placas de cultura de tecidos de 24 poçosFalcon353935
40µ filtro de células mFisher Scientific22368547
tubos cônicos de 50mlFalcon352098
pipetas sorológicas de 5mlFisher Scientific13-676-10H
60mmFalcon353002
70µ filtro de células mFisher Scientific22363548
Alexa Fluor 488 anticorpo secundário IgG (H+L) de cabra anti-camundongoInvitrogenA11001
Alexa Fluor 488 anticorpo secundário IgM (H+L) de cabra anti-coelhoInvitrogenA21042
Alexa Fluor 488 anticorpo secundário IgM (H+L) de cabra anti-coelhoInvitrogenA11008
Alexa Fluor 594 anti-frango IgG (H+L) anticorpo secundáriode cabra InvitrogenA11042
Anti-O4 beads- Anti-O4MicroBeadsMiltenyi Biotec130-094-543
Apo-Transferrin humanoSigmaT1147
Autofil conjunto completo de filtro superior de garrafa, filtro de 0.22um, 250mlUSA Scientific6032-1101
Autofil filtro completo de topo de garrafa montagem, filtro de 0.22um, 250mlSuplemento B27 da USA Scientific6032-1102
Invitrogen17504-044
Ácido bóricoSigmaB7660
Soro de Crescimento Bovino (BGS)GE Healthcare Life SciencesSH30541.03
BSAFisher ScientificBP-1600-100
CNTFPeprotech450-50
d-BiotinaSigmaB4639
Desoxirribonuclease I (DNAse I)WorthingtonLS002007
EDTAFisher ScientificS311
com câmera Olympus DP70OlympusBx51
Bisturis descartáveis de penasAndwin ScientificEF7281C
ForskolinSigmaF6886
lamínulas de vidro alemãs, espessura #1, diâmetro de 12mm redondoAnticorpo GFAP NeuVitroGG-12-oz
AvesGFAP
GlicoseFisher ScientificD16-1
GlutaMAXInvitrogen35050-61
InsulinaInvitrogen12585-014
Suporte separador magnético - MACS multistandMiltenyi Biotec130-042-303
Separador magnético-MiniMACS separadorMiltenyi Biotec130-042-302
Millex PES 0.22µ m unidade de filtroMilliporeSLG033RS
Mídia de montagem- Prolongue o ouro com DAPIThermo FisherP36930
N-acetil-cisteína (NAC)SigmaA8199
Natural mouse lamininInvitrogen23017-015
Neurobasal Medium AInvitrogen10888-022
Neurotrophin-3 (NT-3)Peprotech450-03
NG2 anticorpoMilliporeAB5320
PapaínaWorthingtonLS003126
PBS sem Ca2+ e Mg2+SigmaD5652
PDGFPeprotech100-13A
Placas de PetriFalcon351029
Poly-D-LysineSigmaP6407
PrimocinInvivogenant-pm-2
ProgesteronaSigmaP8783
PutrescineSigmaP5780
Coluna de seleção-colunas LSMiltenyi Biotec130-042-401
Selenito de sódioSigmaS5261
Oligoelementos BCorning25-000-CI
Triiodotironina (T3)SigmaT6397
Triton-XSigmaT8787
Solução Azul de TripanoCorning25-900-CI
Tween 20SigmaP1379
B27NBMA487,75 mL Meio Neurobasal A; 10 mL de suplemento de B27; 1 mL de Primocin; 1,25 mL de Glutamax; Filtre, esterilize e armazene a 4 graus; C até o uso.
B27NBMA + 10% BGS27 mL B27NBMA; 3 mL Estoque de solução de CNTF de soro
(10 µ g/ml; 1000X)Encomenda da Peprotech (450-50). Perfazer a dose de 0,1 a 1 mg/ml, de acordo com o fabricante» s (pode variar de lote para lote) em buffer (por exemplo, DPBS + 0.2% BSA). Armazenar a -80 °C.
Solução de trabalho (10 µ g/ml, 1000X)
1. Faça 0,2% de BSA (Fisher scientific BP-1600-100) em solução de DPBS e esterilize por filtro.
2. Aliquota de estoque mestre diluída para 10µ g/ml em BSA/DPBS.
estéril, refrigerado a 0,2% 3. Alíquota (20µ l/tubo) e congelamento instantâneo em nitrogênio líquido.
4. Armazene alíquotas a -80 ° C.
d-Biotina solução estoque (50 µ g/ml; 5000X)Ressuspenda a d-biotina (Sigma-B4639) em H2O bidestilado a 50 µ g/ml (por exemplo, 2,5 mg em 50 ml de ddH2O). A ressuspensão pode levar uma boa quantidade de agitação / vórtice ou um leve aquecimento brevemente a 37 ° C. Se a d-biotina ainda não for solubilizar, não há problema em fazer um menos concentrado (por exemplo, 10µ g/ml) e adicionar um volume maior ao B27NBMA (1/1000), em vez de 1/5000). Armazene a 4 graus C.
Solução de estoque1. Dissolver a 12.500 U de desoxirribonuclease I/ml em HBSS resfriado em gelo.
2. Esterilizar por filtro em ice
3. Alíquota em 200 µ l e congelar durante a noite a -20& 4. Armazene alíquotas de -20 a -30 graus.
Dulbecco' s Solução salina tamponada com fosfato (sem Ca2+ e Mg2+)Dissolva a bolsa em 1 litro de água para produzir 1 litro de meio a 9,6 gramas de pó por litro de meio. Armazene a 2-8 ° C.
Solução estoque de forscolina (4,2 mg / ml; 1000X)Adicione 1 ml de DMSO estéril a 50 mg de forscolina no frasco (Sigma-F6886) e pipete até ressuspendê-lo. Transferir para um tubo de centrifugação de 15 ml e adicionar 11 ml de DMSO estéril para perfazer 4,2 mg/ml. Alíquota (por exemplo, 20 µ l) e armazene a -20 graus C.
Hank' s sais balanceados (HBSS) (Sigma1. Meça 900 ml de água (temperatura 15-20 ° C) em um cilindro e mexa delicadamente.
2. Adicione a potência e mexa até dissolver.
3. Enxágue a embalagem original com uma pequena quantidade de água para remover todos os vestígios do pó.
4. Adicione à solução na etapa 2.
5. Adicionar 0,35 gr de bicarbonato de sódio (7,5% p/v) para cada litro de volume final.
6. Continue mexendo até dissolver.
7. Ajuste o pH do tampão enquanto agita para 0,1-0,3 unidades abaixo do pH = 7,4, pois pode aumentar durante a filtração. Recomenda-se o uso de HCl 1N ou NaOH 1N para ajustar o pH.
8. Adicione mais água para trazer o volume final para 1L.
9. Esterilizar por filtração usando uma membrana com porosidade de 0,22 mícrons.
10. Armazene a 2-8 ° C.
Insulina estoque (4000 µ g/ml)Descongele a garrafa e alíquota 25 µ l por tubo de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C.
de lamininaDescongele lentamente a laminada no frio (2° C a 8° C) para evitar a formação de gel. Em seguida, alíquota em tubos de polipropileno. Armazene a 5° C a -20 graus C em alíquotas (por exemplo, 20 µ l) e não congele/descongele repetidamente. A laminina pode ser armazenada nessas temperaturas por até seis meses.
Classificação de Células Magnéticas (MCS)Prepare a solução contendo solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,2 e 0,5% de albumina de soro bovino (BSA), 0,5 mM EDTA, 5µ g/ml de insulina, 1 g/L de glicose. Esterilize e desgaseifique filtrando o tampão passando-o por um 0,22 µ m Filtro Millex. Armazene o buffer a 4° C até o uso
solução estoque de N-acetil-L-cisteína (NAC) (5mg/ml; 1000X)Dissolver N-acetil-L-cisteína (Sigma-A8199) a 5 mg/ml em DMEM (por exemplo, 50 mg de NAC em 10 ml B27NBMA). Filtrar, esterilizar e alíquota (por exemplo, 20 µ l). Armazene a -20 graus C.
NT3 solução-mãe (1 µ g/ml; 1000X)Estoque mestre:
Pedido da Peprotech (450-03). Perfazer a dose de 0,1 a 1 mg/ml, consoante o fabricante» s instruções (pode variar de lote para lote), em buffer (por exemplo, DPBS + 0,2% BSA). Armazene a -80&C.

Estoque de trabalho (1µ g/ml; 1000X):
1. Faça 0,2% de BSA em solução de DPBS e esterilize por filtro.
2. Dilua a alíquota do estoque mestre para 1 µ g/ml em BSA/DPBS.
estéril, refrigerado a 0,2% 3. Alíquota (por exemplo, 20µ l/tubo) e congelamento instantâneo em nitrogênio líquido.
4. Armazene alíquotas a -80 graus C.
Solução estoque PDGF (10 µ g/ml; 1000X)Estoque mestre:
Pedido da Peprotech (100-13A). Perfazer a dose de 0,1 a 1 mg/ml, consoante o fabricante» s instruções (pode variar de lote para lote) em buffer (por exemplo, DPBS) + 0,2% BSA). Armazene a -80&C.

Estoque de trabalho (1µ g/ml; 1000X):
1. Faça 0,2% de BSA em solução de DPBS e esterilize por filtro.
2. Dilua a alíquota do estoque mestre para 1µ g/ml em BSA/DPBS.
estéril, refrigerado a 0,2% 3. Alíquota (por exemplo, 20µ l/tubo) e congelamento instantâneo em nitrogênio líquido.
4. Armazene alíquotas a -80 graus C.
Poli-D-lisina (1mg/ml; 100X)Ressuspende poli-D-lisina, peso molecular 70-150 kD (Sigma P6407) a 0,5mg/ml em ácido bórico 0,15M pH 8,4 (por exemplo, 50mg em tampão borato de 50ml). Esterilização por filtro e alíquota (por exemplo, 100µ l/tubo). Armazene a -20 graus C. Antes de usar, dilua o estoque 100X (1 mg / ml) para 50 & micro; g/ml em água estéril.
Meios de, consulte Tabela suplementar 1
Meiosconsulte Tabela suplementar 1
Suplemento Sato (100X)ver Tabela Suplementar 1
Referências: a lista de reagentes e receitas foi adotada a partir dos protocolos descritos anteriormente por Emery et. al. 2013 (Emery, B. & Dugas, J. C. Purificação de células de linhagem de oligodendrócitos de córtices de camundongos por imunopanning. Protoc Harb de Primavera Fria. 2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) e Dincman et. al. (Dincman, T. A., Beare, J. E., Ohri, S. S. & Whittemore, S. R. Isolamento de células precursoras de oligodendrócitos corticais de camundongos. J Métodos Neurosci. 209 (1), 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))
de 10ml Fisher Scientific Placas de cultura de tecidos Microscópio de epifluorescência de crescimento bovino DNase I Solução Tampão de proliferação de oligodendrócitos de diferenciação de oligodendrócitos,

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