Визуализация мотор Axon навигации и количественной оценки Axon арборизация эмбрионов мыши, с помощью микроскопии флуоресцирования света лист
Summary
Здесь мы описываем протокол для визуализации мотонейрона проекции и аксон арборизация в трансгенной эмбриона мыши Hb9::GFP . После иммуноокрашивания для двигательных нейронов мы использовали свет лист флуоресцентной микроскопии для изображения эмбрионов для дальнейшего количественного анализа. Этот протокол применяется к другим процессам навигации нейрон в центральной нервной системе.
Abstract
Мотонейронов спинного мозга (MNs) расширить их аксоны общаться с их innervating цели, тем самым контроль движения и сложные задачи в позвоночных. Таким образом важно выявить молекулярные механизмы как Мотор аксоны перейдите к arborize и иннервируют их периферические миорелаксанты цели во время разработки и дегенерации. Хотя трансгенных линий мыши Hb9::GFP долго служил для визуализации траекторий двигателя аксона во время эмбрионального развития, подробные описания полного спектра терминала арборизация аксона остаются неполными ввиду сложности шаблон и ограничения текущей оптической микроскопии. Здесь мы описываем улучшение протокол, который сочетает в себе свет лист флуоресцентной микроскопии (LSFM) и анализ надежной изображений и количественно и качественно визуализировать развивающихся мотор аксоны. Эта система может быть легко принял пересечь генетических мутантов или MN болезни модели с Hb9::GFP линиями, раскрывая новые молекулярные механизмы, которые приводят к дефектам в мотор аксона навигации и арборизация.
Introduction
MNs позвоночника являются частью центральной нервной системы, но иннервируют периферийных мышцы для контроля движения. В развивающихся спинного мозга MN прародителями (ПНЛ) устанавливаются согласно сигналы, исходящие от хорда и смежные сегменты. Все продифференцировано пост митотическая MNs затем создаются из ПНЛ, в конечном счете порождает ряд подтипов MN вдоль оси rostrocaudal спинного1,2. Позвоночника MNs топографически и анатомически хорошо организованы. Расположение их морфологические коррелирует с позиции их соответствующих целевых в периферии3. По достижении их целей мышц, аксоны получать сотовой и экзогенных нейротрофических факторов, которые побудить их расширения и филиал в мышцы. Иннервация и ветвления дефекты могут способствовать несоздания нервно развязок (NMJ). Например, глиальные нейротрофического факторы (GDNF)-индуцированной Pea3 является необходимым условием для арборизация аксона в кожный maximus (см) и мышцы, широчайшая мышца спины (LD)4,5. Кроме того рестораны нокаут мыши эмбрионов показывают дефектных арборизация диафрагмального нервов в диафрагмы, вызывая дыхательной недостаточности и смертности сразу же после рождения6,7. Таким образом этот последний шаг MN созревания (то есть, аксональное проекции и ветвление) имеет решающее значение для обеспечения связи между нейронами и клеток-мишеней.
Чтобы просмотреть шаблоны арборизация, исследователи обычно проводят конфокальная томография или легкие микроскопии флуоресцирования двух Фотон секционного или целое гора образцов8,9,10. Оба эти методы микроскопии генерировать приемлемое разрешение и глубину проникновения. Световой микроскопии флуоресцирования двух Фотон предполагает возбуждения флуорофоров одновременное поглощение двух нижнего энергии фотонов11. Поскольку два Фотон возбуждения использует ближнего инфракрасного излучения, снижение возбуждения частоты способствует уменьшение рассеяния и лучшего проникновения ткани до 1 мм в ткани, таким образом позволяя изображений с большей глубиной. Конфокальная микроскопия удаляет фильтры из фокус сигналов и только собирает свет в пределах фокальной плоскости12. С этим подходом изображения образцов из разных фокальной плоскости могут быть объединены для получения трехмерных (3D) изображения через функцию Z-стека. Тем не менее интенсивность сигнала снижается, как большинство свет блокируется и высокой численного отверстия закрывают глубина резкости. Что еще более важно обе методики способствуют тяжелые фотоповреждения и Фототоксичность поскольку весь образец получает свечение, даже тогда, когда только один самолет отображаемого в данный момент.
Чтобы обойти эти недостатки, LSFM стал благоприятствования альтернативы, с преимуществами, быстро, эффективно свет и меньше фототоксических13,14. Кроме того LSFM позволяет нескольких изображений. Этот подход особенно подходит для визуализации мотор аксонов и их диспергирования терминалы, как они распространились в трехмерном пространстве. LSFM превосходит другие два варианта, поскольку образцы устанавливаются на сцене, которая позволяет вращение вокруг вертикальной оси и движения вдоль x, y и z оси. Эта установка позволяет не только минимально заблокированных вид образца, но и выбор желательной освещение пути, недостаток двух фотонов и конфокальная микроскопия, оба из которых требуют монтажа образцов на слайде плоских. Таким образом LSFM является наиболее подходящим инструментом для 3D визуализации арборизация аксона и количественного определения двигательного нерва терминалов в эмбрионов мыши.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несколько шагов в протоколе могут подвергаться изменениям при определенных обстоятельствах. Например длительность фиксации зависит от возраста эмбрионов, колеблется от 2 h 1 или более дней, используя свежеприготовленные параформальдегида. Так как фиксация осуществляется до вся гора и…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
LSFM экспериментов и анализ данных проводились в части с помощью передовых оптических микроскопов службу отдела инструмент в Синика и при содействии г-жи Шу-Чэнь Шэн. Мы благодарим г-жа Сью-пинг ли от Imaging основного объекта IMB для значительной технической помощи с анализа изображений Imaris. IMB научных Английский редактирования основных рассмотрел рукопись. Эта работа финансируется Academia хвощевой карьеры развитию премии (CDA-107-L05), наиболее (104-2311-B-001-030-MY3) и национальных правозащитных учреждений (НПУ-EX106-10315NC).
Materials
| Hb9::GFP | The Jackson labortory | 005029 | Collect embryos of embryonic day 13.5 (E13.5) |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | For 200ml: Add 20ml 10X PBS, 8g PFA in ddH2O. Adjust pH to 7.4 with NaOH (10N). Filter sterilize and store at -20 °C. | ||
| Phosphate buffer saline 10X (PBS 10X) | For 1L: Add 80 g NaCl, 2 g KCl,14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4 and top up with ddH2O. Autoclave and store at RT. | ||
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher | 26140079 | |
| Sheep polyclonal anti-GFP | AbD Serotec | 4745-1051 | 1:1000 |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep | Invitrogen | A-11015 | 1:1000 |
| RapiClear 1.47 clearing reagent | SunJin Lab | RC147001 | |
| 1.5ml micro tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 24 wells plate | ThermoFisher | 142475 | |
| 5 SA Tweezer | ideal-tek | 3480641 | |
| Iris Scissors striaght sharp/sharp | Aesculap | BC110R | |
| Microsurgery Scalpels, single use | Aesculap | BA365 | |
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | |
| Shaker | TKS | RS-01 | |
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Imaris 8.4.0 image analysis software | Bitplane, Zurich, Switzerland | ||
| B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J (Hb9::GFP mice) | The Jackson Laboratory | 005029 |
Referências
- Davis-Dusenbery, B. N., Williams, L. A., Klim, J. R., Eggan, K. How to make spinal motor neurons. Development. 141, 491-501 (2014).
- Stifani, N. Motor neurons and the generation of spinal motor neuron diversity. Front Cell Neurosci. 8, 293 (2014).
- Kania, A., Jessell, T. M. Topographic motor projections in the limb imposed by LIM homeodomain protein regulation of ephrin-A:EphA interactions. Neuron. 38, 581-596 (2003).
- Livet, J., et al. ETS gene Pea3 controls the central position and terminal arborization of specific motor neuron pools. Neuron. 35, 877-892 (2002).
- Kanning, K. C., Kaplan, A., Henderson, C. E. Motor neuron diversity in development and disease. Annu Rev Neurosci. 33, 409-440 (2010).
- Matsumoto, S., Kiryu-Seo, S., Kiyama, H. Motor Nerve Arborization Requires Proteolytic Domain of Damage-Induced Neuronal Endopeptidase (DINE) during Development. J Neurosci. 36, 4744-4757 (2016).
- Nagata, K., et al. ECEL1 mutation implicates impaired axonal arborization of motor nerves in the pathogenesis of distal arthrogryposis. Acta Neuropathol. 132, 111-126 (2016).
- Catela, C., Shin, M. M., Lee, D. H., Liu, J. P., Dasen, J. S. Hox Proteins Coordinate Motor Neuron Differentiation and Connectivity Programs through Ret/Gfralpha Genes. Cell Rep. 14, 1901-1915 (2016).
- Bonanomi, D., et al. Ret is a multifunctional coreceptor that integrates diffusible- and contact-axon guidance signals. Cell. 148, 568-582 (2012).
- Tung, Y. T., et al. Mir-17 approximately 92 Governs Motor Neuron Subtype Survival by Mediating Nuclear PTEN. Cell Rep. 11, 1305-1318 (2015).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Jonkman, J., Brown, C. M. Any Way You Slice It-A Comparison of Confocal Microscopy Techniques. J Biomol Tech. 26, 54-65 (2015).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Methods. 12, 30-34 (2015).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59, 129-138 (2011).
- Hanley, O., et al. Parallel Pbx-Dependent Pathways Govern the Coalescence and Fate of Motor Columns. Neuron. 91, 1005-1020 (2016).
- De Marco Garcia, N. V., Jessell, T. M. Early motor neuron pool identity and muscle nerve trajectory defined by postmitotic restrictions in Nkx6.1 activity. Neuron. 57, 217-231 (2008).
- Li, C. J., et al. MicroRNA filters Hox temporal transcription noise to confer boundary formation in the spinal cord. Nat Commun. 8, 14685 (2017).
- Swoger, J., Pampaloni, F., Stelzer, E. H. Light-sheet-based fluorescence microscopy for three-dimensional imaging of biological samples. Cold Spring Harb Protoc. 2014, 1-8 (2014).
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 327-339 (2014).
- Reynaud, E. G., Tomancak, P. Meeting report: first light sheet based fluorescence microscopy workshop. Biotechnol J. 5, 798-804 (2010).
