Protokollen præsenterer Escherichia coli-baseret selektivt pres indarbejdelse af ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) i lactococcal antimikrobielle peptid nisin. Dens egenskaber kan ændres under rekombinant udtryk via substitution med ønskede ncAAs i definerede vækst medier. Deraf følgende ændringer i bioactivity er kortlagt af vækst hæmning assays og Fluorescens mikroskopi.
Naturen har en bred vifte af muligheder for at skabe nye protein funktioner ved at ændre rækkefølgen af enkelte aminosyre-byggesten. Alle varianter er imidlertid baseret på de 20 kanoniske aminosyrer (CAA). Som en måde til at indføre yderligere fysisk-kemiske egenskaber i polypeptider, bruges inddragelsen af ikke-kanoniske aminosyrer (ncAAs) i stigende grad i protein engineering. På grund af deres relativt korte længde er ændring af ribosomally syntetiseret og post-translationally modificeret peptider af ncAAs særligt attraktive. Nye funktionaliteter og kemiske håndtag kan genereres ved særlige ændringer af enkelte rester. Selektiv pres indarbejdelse (SPI) metode udnytter auxotrophic vært stammer, der er berøvet en essentiel aminosyre i kemisk definerede vækst medier. Flere strukturelt og kemisk lignende aminosyre analoger kan derefter aktiveres af den tilsvarende aminoacyl-tRNA syntetase og give rest-specifikke cAA(s) → ncAA(s) udskiftninger i target peptid eller protein sekvens. Selv om i forbindelse med metoden SPI, ncAAs indgår også i vært proteomet fase af rekombinant genekspression, tildeles størstedelen af cellens ressourcer til ekspression af target-genet. Dette giver mulighed for effektiv rest-specifikke indarbejdelse af ncAAs ofte ledsaget med store mængder af modificerede mål. Det præsenterede arbejde beskrives i vivo -inkorporering af seks prolin analoger i antimikrobielle peptid nisin, et lantibiotic, naturligt produceret af Lactococcus lactis. Antimikrobielle egenskaber af nisin kan ændres og yderligere udvidet i løbet af sin gæring og udtryk i auxotrophic Escherichia coli stammer i definerede vækst medier. Dermed, kan virkningerne af rest-specifikke udskiftning af CAA med ncAAs levere ændringer i antimikrobiel aktivitet og specificitet. Antimikrobiel aktivitet assays og Fluorescens mikroskopi bruges til at teste de nye nisin varianter for væksthæmning af en Gram-positive Lactococcus lactis indikator stamme. Masse spektroskopi bruges til at bekræfte ncAA indarbejdelse i bioaktive nisin varianter.
Opdagelsen af antibiotika i det tyvende århundrede og den parallelle udvikling af nye antimikrobielle forbindelser mod sygdomsfremkaldende mikroorganismer aktiveret målrettede behandlinger af bakterielle infektioner. Men, på grund af fremkomsten af multidrug-resistente patogene organismer såsom methicillin-resistente Staphylococcusaureus (MRSA), vancomycin-resistente enterokokker (VRE), MDR (multiresistente) Salmonella typhimurium phage skrive 10 (DT10 ), og Klebsiella pneumoniae, det er tvingende nødvendigt at generere nye antimikrobielle stoffer1. Antimikrobielle peptider (AMP’er) er alsidigt, ofte meget specifikke forbindelser, der er lovende kandidater til udvikling af nye stoffer takket være deres fysisk-kemiske egenskaber, fleksibilitet, størrelse, hydrophobicity og tilstand af aktion2. Ampere er små peptider, som normalt består af 7-100 aminosyrer. De har ofte, en kationiske struktur rige i positivt ladede arginin og lysin restprodukter, som interagerer med den målrettede mikrobielle cellemembranen, som debiteres oppositely3. En særlig undergruppe af ampere er ribosomally syntetiseret og posttranslationally modificeret peptider (RiPPs)4. Disse er fremstillet af mange organismer fra Kongeriget svampe og bakterier-domænet. En af de bedst kendte og udbredte RiPPs er nisin, naturligt produceret af mælkesyre bakterie Lactococcus lactis (L. lactis). Aktivt mod et panel af Gram-positive bakterier, nisin er blevet brugt som en biopreservative i fødevareindustrien i mere end 50 år på grund af sin antimikrobielle egenskaber og fravær af udviklede resistens i målrettede mikrobielle stammer5. Undersøgelser har vist, at nisin destabiliserer og genererer porer i bakteriel cellemembraner, fører til antimikrobiel aktivitet mod både Gram-positive og Gram-negative patogener6. Ved binding til lipid II er bakterielle cellevæg syntesen hæmmet7. Nisin er kodet af nisA som en lineær forløber peptid, som er sammensat af en leder og en core peptid region (figur 1). Efter ribosomale syntese ændres prenisin først dehydratase NisB. Her, er Serin og Threonin restkoncentrationer i regionen prepeptide core dehydreret dehydroalanine (Dha) og dehydrobutyrine (Dhb)8. Efterfølgende, dehydreret rester er kombineret med cystein til form lanthionine ringe (deraf navnet “lantibiotic” for lanthionine ring-holdige antibiotika) af en enzym-katalyserede Michael tilføjelse. Denne posttranslationelle modifikation (PTM) er katalyseret af cyclase NisC. I L. lactis, den modificerede prenisin er derefter transporteres ud af cellen af transportør NisT og leder peptid er kløvet af proteinase NisP at frigive modne og aktive nisin form9. Den ansvarlige leder peptidase NisP har en høj substrat specificitet, da det kun processer modificeret nisin effektivt10.
I almindelighed, skyldes aktive RiPPs virkningen af PTM enzymer (f.eks NisBC), som drastisk øger den kemiske plads kort peptider, fx via acetylation, glykosylering, methylering eller fosforylering. Dette niveau af kompleksitet kan yderligere udvides ved en direkte inkorporering af ncAAs. Mens ofte muligt, er kemisk syntese af ampere en udfordring for storproduktion på grund af deres strukturelle kompleksitet. For eksempel, blev den samlede kemisk syntese af lantibiotic lactosin S i 71 reaktion trin opnået med en endelige udbytte på 10%, og at af nisin med en grov udbytte af kun 0,003%11,12. Derfor, biologisk produktion tilbyder et levedygtigt alternativ, på grund af generation af korrekte stereocenters og høj koncentration.
Op til i dag, mere end 150 ncAAs, f.eks., at have funktionelle grupper der indeholder fluor eller azider, er blevet indarbejdet i rekombinante proteiner, og flere eksempler på ncAA-modificerede ampere har været rapporteret13,14, 15,16. Med indførelsen af ncAAs, kan roman fysisk-kemiske egenskaber genereres i forhold til konventionelle mutagenese. Mangfoldighed af eksisterende peptider kan øges, eventuelt fører til nye antibiotika.
En metode til indbygning af ncAAs i rekombinant peptider er selektivt pres indarbejdelse (SPI) baseret på brugen af auxotrophic bakteriestammer17. Disse stammer er ikke i stand til at syntetisere den tilsvarende cAA analog af ncAA. Metoden bruger hyppigt bemaerket afslappet substrat specificitet, en funktion i mange naturlige aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs)18. Ud over deres naturlige cAA substrater er disse enzymer ofte i stand til at genkende og aktivere den ønskede ncAA og oplade det på deres beslægtet tRNA(s). Dette fører til ribosomale indarbejdelse af ncAA ind i målet gen produktet i en rest-specifik måde (dvs., cAA → ncAA substitution). Dette er naturligvis kun mulig, når den ønskede ncAA er strukturelt og kemisk svarer til den kanoniske aminosyre og tolereres af celle fysiologi, oversættelse maskiner og target peptid eller protein sekvens. I en særlig eksperimentel opsætning, er auxotrophic værtsceller kulturperler i definerede medium leveres med en begrænsende koncentration af den oprindelige aminosyre til erstattes. Den cellulære vækst eller udveksling af cAA-frit medium fører til intracellulær nedbrydning af cAA. I det næste trin, ncAA er tilføjet og genekspression mål er induceret. Uundgåeligt, ncAAs er nu også indarbejdet i mange andre proteiner i cellen vært i denne fase af target genekspression. Ikke desto mindre toksicitet af opsætningen af SPI er holdt på et lavt niveau siden Escherichia coli (E. coli) stamme er transformeret med et plasmid bærer target gen under kontrol af en stærk fortaler (almindeligvis den konkurrenceprægede T7 promotor / RNA polymerase system)19. Straks efter induktion (som regel når cAA er opbrugt), værten celler ophører med at vokse og deres cytoplasmatisk enzymatisk machineries anvendes primært til udtryk af plasmid-baseret mål-genet. Site-directed mutagenese kan bruges til at definere websteder af rest-specifikke ncAA installation i target gen20.
Som en model peptid for indarbejdelse af ncAAs, blev pentacyclic AMP nisin A valgt. Det er 34 aminosyrer lange og har kun en enkelt prolin rester i core peptid sekvens (figur 1). Subtilisin, ericin A og S og epidermin såvel som i nisin Z og nisin Q synes den bevarede prolin at være afgørende for aktivitet9,21. CAA prolin spiller en særlig vigtig rolle i peptidyl-prolyl akrylamid rotation og sekundær struktur stabilisering. Sin sidekæde ring konformationer (exo / endo puckers) er ansvarlig for et termodynamisk stabilisering af akrylamid bond. Målrettet kemiske ændringer (f.eks. hydroxylations, fluorinations, methylations) af prolyl rynker påvirke ofte kritisk folde stabilitet, stillads stivhed og funktioner af mange biologiske strukturer22. Derfor er det plausibelt at forvente at Pro→ prolin analog erstatninger vil begave ring B, den anden ring af nisin, med roman og usædvanlige egenskaber.
Her, en prolin-auxotrophic E. coli stamme blev brugt til fremstilling af rekombinant nisin. Dette kræver et udtryk for prepeptide gen nisA samt ændring enzym gener nisBC. Genetisk kodet peptid produktet bærer en N-terminalt hans markeret leder til rensning via affinitet kromatografi. Til bestemmelse af aktivitet bruges L. lactis udtrykker og udskiller NisPT til at aktivere rekombinant nisin varianter fra E. coli cellelysater eller renset peptid prøver (figur 1). Den modne AMP er frigivet efter spaltning af lederen af NisP. I denne agar diffusion metode, AMP prøven diffunderer ind i solid vækstmediet og kan hæmme væksten af de Gram-positive mikroorganisme. Efter inkubation, kan dette iagttages visuelt ved vækst hæmning glorier. Ud over L. lactis som indikator, ændret nisin varianter viste antimikrobiel aktivitet mod Enterococcus faecalis, Bacillus cereusog Staphylococcus aureus, Lactobacillus johnsonii 21,23.
En alternativ og eksperimentelt anderledes metode at indarbejde ncAAs i RiPPs er stop-codon suppression (SCS)24. For dette, en ortogonale tRNA / aminoacyl-tRNA syntetase (aaRS) par der kræves for den tilsvarende ncAA. Ideelt set, alle disse tre komponenter er bioorthogonal, dvs., de ikke interagere med den endogene tRNAer og aaRSs. En ncAA-specifikke aaRS kan genereres ved ændring af det enzym aktive site og screening af genetiske biblioteker af mutant synthetases25. Derudover kræver indførelsen af en ncAA en codon, som er overført og som ikke koder for cAA. Almindeligt, er rav stop-codon anvendte24,26.
For nylig, SPI blev etableret for indarbejdelse af α-chloracetamid-holdige og klik-kemi-kompatible ncAAs i NisA27. For eksempel, var Nε– alloc-lysin indarbejdet i lasso peptid captistruin med lokationsspecifikke (SCS) og rest-specifikke (SPI) iblanding metoder og efterfølgende modificeret in vitro af ruthenium-katalyseret metathesis28 . I forhold til SPI, SCS metode er mere komplicerede siden en ortogonale tRNA / aaRS par må være co udtrykt. Til dato, o-par for prolin indarbejdelse har været udviklede29, men til bedste af vores viden, ingen eksempel prolin analog vedtægter er blevet rapporteret.
Det skal bemærkes, at ikke alle ncAAs kan indarbejdes ved hjælp af metoden SPI. Først, optagelsen af ncAAs i cytoplasma er reguleret af en lang række transport proteiner, der er indlejret i den cytoplasmatiske membran, som er den indre membran for gramnegative bakterier som E. coli. E. coli er normalt i stand til at transportere en bred vifte af aminosyre analoger ind i cellen med sidekæder strukturelt og kemisk ligner kanoniske aminosyrer. Andet, mange kemisk reaktive eller ustabile ncAAs kan fungere som en inhibitor mod cellulære vækst, da de er giftige for stofskiftet og fysiologi af værten celle30. Således, optagelse og toksicitet af ncAA for produktion vært skal testes på forhånd. Du kan undgå inaktivering af PTM maskiner som en bivirkning ved et strengt kontrolleret udtryk opsætningen af de ansvarlige gener kan bruges til at indarbejde den naturlige aminosyre i ændring enzymer (f.eks. nisBC) og ncAA i target-genet ( fx nisA). Dette kan opnås ved hjælp af to forskellige projektledere og induktion af target genekspression, som påvist i specialdesignet SPI protokoller31. Som skitseret ovenfor, er metoden SPI baseret på afslappet substrat specificiteten af de årlige aktivitetsrapporter, som giver mulighed for ncAA aktivering og beslægtet tRNA opladning. Efterfølgende, er tRNA leveret til ribosomet efterfulgt af akrylamid bond dannelse og foldning af mål (poly) peptid. I denne processer, kan korrekturlæsning og redigering af mekanismer, der blive relevante32. Af disse grunde er det af stor betydning at have et mål ncAA, der er strukturelt og kemisk svarer til cAA. Andre vigtige punkter er tilstrækkelig stabilitet (begge i vækst medier og udsat for den cellulære metabolisme) og Opløselighed af ncAA. Derudover bør det være enten kommercielt tilgængelige eller lette at være syntetiseret kemisk.
Her, beskriver vi en protokol til SPI, at tillade restkoncentrationer-specifikke indarbejdelse af ncAAs i rekombinante RiPPs. Især forskellige prolin analoger er indarbejdet i den antimikrobielle peptid nisin A ved hjælp af E. coli som værtsorganisme. Massespektrometri bruges til at kontrollere aminosyre udskiftning og peptid produkter analyseres for bioactivity ved hjælp af vækst hæmning assays og Fluorescens mikroskopi ved hjælp af mikrobielle indikator stammer.
Den grundlæggende forudsætning for en vellykket rekombinant nisin udtryk med definerede ncAAs kræver en egnet proline auxotrophic E. coli stamme. Til dette auxotrophy, proA må være dysfunktionel, for eksempel opnås ved genomisk knockout. Celler frataget fuldt intracellulære Pro biosyntese (dvs. fjernelse af proABC) uden mulighed for tilbagefald er stabile auxotrophs. Udbredte gen knockout metoder er phage transduktion eller enkelt-gen knockout ifølge Datsenko & Wanner33. Derudover kan proA knockout stammer fås fra offentlige arkiver som Addgene, CGSC eller Keio samling. Da den rekombinante nisABC udtryk vist her er baseret på brugen af T7 initiativtagere, har udtrykket vært stamme til at bære en inducerbar genet for T7 RNA polymerase. Dette kan ske ved tilførsel til vært genom, for eksempel ved hjælp af kommerciel kit af λDE3 prophage. Alternativt kan stammer som BL21(DE3) foretages auxotrophic som beskrevet ovenfor.
Ved hjælp af SPI til indsættelse af prolin analoger, kan målrettet nisin strukturer ændres væsentligt, at skabe nye peptid varianter med unik sekvens kombinationer og kemiske egenskaber. På denne måde, kan den grundlæggende grænse for klassisk genteknologi omgås, som er begrænset til side kæde kemi af de 20 CAA. In vivo kemiske diversificering af nisin som eksemplificeret ovenfor viser en generel tilgang til at supplere naturlige PTMs og dramatisk forbedre den kemiske plads af RiPPs. Vi mener, at udvide repertoiret af de naturlige aminosyrer holder meget lovende især for ampere. I proteiner, kan en enorm vifte af funktionaliteter realiseres gennem en defineret arrangement af de 20 CAA i tre-dimensionelle strukturer. Med kun 7-100 aa i længde3ville måder at opnå sådanne strukturelle funktioner kun via CAA være begrænset til ampere. Det er således ikke overraskende, at naturlige ampere i form af RiPPs er almindeligvis ekstensivt post-translationally modificerede4. I den samme mode, ncAAs som alternative byggesten holder meget lovende til at forbedre deres farmakodynamiske og farmakokinetiske parametre (Se Baumann et al. 201735 og referencer heri).
SPI Metodevalg i dette arbejde fordele fra en forholdsvis nem eksperimentel opsætning, ligetil udførelse og høj reproducerbarhed. På grund af globale substitution er flere lokationer ncAA iblanding i target peptider også muligt. Metoden kan på den anden side ikke være tilstrækkelig for udskiftning af aminosyrer, ofte forekommer i target gen produkt. I princippet, uønskede holdninger kan ændres ved site-directed mutagenese, men disse yderligere ændringer kan også påvirke flere AMP egenskaber herunder struktur og bioactivity. Når en auxotrophic stamme for produktion er tilgængelig, kan flere ncAAs prøves uden at kræve omfattende ændringer på det genetiske niveau. Desuden er metoden er ikke begrænset til auxotrophic E. coli stammer, men kan også udføres ved hjælp af den naturlige produktion vært. For eksempel, Zhou et al. viste at SPI til produktion af roman RiPPs også virker de naturligt Trp-auxotroph L. lactis: bruger defineret medier, tre tryptophan analoger blev indarbejdet på fire positioner i nisin50.
Da metoden SPI fører til global udskiftning af valgt cAA af ncAA, er det generelt gælder for en bred vifte af target peptider og proteiner. En vifte af auxotrophic E. coli stammer, der er tilgængelige (Se trin 1), tillader flere CAA hver skal testes for udskiftning af ncAAs. Mødte analoger indarbejdet ved hjælp af metA-mangelfuld stammer (f.eks. B834(DE3)) oftest ansat. Eksempler på isostructural Met analoger er azidohomoalanine (Aha) og homopropargylglycine (hypothalamus), kommercielt tilgængelige ncAAs, som kan indarbejdes effektivt. Både indføre bioorthogonal håndtag, som giver mulighed for fastgørelse af molekyler transporterer en kompatibel alkyn eller indeholder funktionalitet, henholdsvis. For eksempel, fluorescerende farvestoffer eller polyethylenglycol (PEG) fraspaltning kan knyttes af kobber (I)-katalyseret indeholder alkyn cycloaddition (CuAAC)51.
Selv om begge rekombinant ncAA indarbejdelse metoder (SPI og SCS) normalt opnå tilstrækkelige mål mængder, udbyttet er ofte reduceret i forhold til wild-type produktion af den tilsvarende peptider og proteiner. Da purities ofte korrelerer med produktionseffektivitet, kan yderligere rensning trin være nødvendig, især for lav-rigelige arter. I dette tilfælde af rekombinant nisin produktion forenkler hans-tagged leder sekvens RiPP rensning af selektiv berigelse fra cellelysater. Rensning vist i denne protokol forbedrer renhed og koncentration af nisin, men ofte giver ikke AMP purities tilstraekkeligt at fastslaa udbyttet og specifikke aktivitet. Udover IMAC, almindeligt anvendte AMP rensning metoder omfatter HPLC, ionbytning kromatografi (IEC) og nedbør (fx. ved hjælp af acetone eller trichloreddikesyre (TCA)) eller kombinationer heraf – hvilket resulterer i en omstændelig rensning ordning52 . Det skal bemærkes, at deres almindeligt polycationic karakter kan lette IEC rensning. Frysetørring er ofte bruges til at gemme renset ampere.
Ideelt set ncAAs til indbygning i ampere skal være kommercielt tilgængelige til overkommelige priser eller produceret let af simpel og reproducerbar kemisk syntese protokoller. En lige så vigtig forudsætning for metoden SPI er at ncAA er anerkendt, aktiveret og opkræves på et beslægtet tRNA af den endogene eller sammen udtrykt aaRS. Dette kan være testet in vitro- af aminosyre aktivering eller tRNA aminoacylation assay53. Som et let alternativ, SPI test udtryk af model proteiner som grøn fluorescerende proteiner (NGL) udført både i tilstedeværelse og i mangel af ncAA tilskud kan udføres. Derudover Opløselighed i vækst medium og celle permeabilitet samt kemiske stabilitet udgør vigtige faktorer.
I dette eksempel, blev antimikrobiel aktivitet screenet ved hjælp af en Gram-positive indikator stamme. Som det udtrykker leder peptidase NisP, katalyseret det sidste trin af nisin modning. Fjernelse af leader-sekvens (hans-markeret til rensning formål) kan også være udført i vitro ved behandling med oprenset NisP50 eller trypsin54. Ud over dette arbejde, kan patogene organismer og multidrug resistente stammer derefter testes for bakteriostatisk eller bakteriedræbende hæmning af ampere ved hjælp af en lignende metode. Klinisk relevante målarter omfatter MRSA, MDR Mycobacterium tuberculosis, VRE, Acinetobacter baumannii, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa og Klebsiella pneumoniae. Udover agar plade diffusion assay præsenteres her, vækst hæmning kan også udføres ved hjælp af passende flydende medier podet med de bakteriearter og suppleret med AMP. Du bruger bouillon fortynding metoder, kan den minimale hæmmende koncentration (MIC) bestemmes ved hjælp af pure peptider55. Aktivitet assay præsenteres her kan også bruges til at vurdere bioactivity og styrken af AMP-holdige løsninger i forhold til reference forbindelser, for eksempel kommercielt tilgængelige nisin.
Rekombinant produktion af RiPPs er ofte muligt39, som almindeligvis omfatter Co udtryk for PTM gener. Så snart produktion stammen er overført til en kemisk definerede eller syntetiske minimal medium indeholdende en egnet ncAA, finder rest-specifikke udskiftning af tilsvarende cAA sted. Således kan andre RiPPs produceres af den samme metode, forudsat at deres rekombinant produktion er gennemførlig og betingelser kan findes hvor ncAA indarbejdelse og PTM give tilstrækkelige mængder af target produkt. Bemærk, at udover vært celle proteomet, peptid PTM maskiner kan også blive ncAA-ændret under SPI. Timingen af target udtryk induktion og længden af følgende inkubationstiden kan derfor kræver optimering. Da ncAA iblanding i PTM enzymer kan påvirke deres stabilitet og aktivitet, kan fremstilling af de forarbejdede RiPP i princippet blive påvirket. Tilstrækkelig PTM enzym effektivitet er angivet med dannelsen af forarbejdede prepeptide, som registreres af MS og bioactivity assays. Som indført ovenfor, forskellige inducerbar initiativtagere kan være ansat for at producere PTM gener først (i mangel af ncAA) efterfulgt af induktion af forløber peptid gen i tilstedeværelse af ncAA. Generelt skal produktionen af cAA-holdige target peptid undertrykkes før tilsætning af ncAA, hvorfor stramme undertrykkelse af forløber genet er påkrævet. Inden for denne protokol opnås dette ved kataboliske undertrykkelse gennem tilsætning af glucose til vækstmediet. Især da PTM enzymer kræves til prepeptide forarbejdning stammer normalt fra en genetisk fjerne vært, kan udtryk temperatur og codon brugen af de tilsvarende gener kræve optimering hvis rekombinant produktion ikke er endnu blevet etableret. I princippet, tilstedeværelsen af ncAAs i prepeptide kan blande sig med anerkendelse og behandling af PTM enzymer, i tilfælde af nisin NisBC og NisP. Til ncAA indbygning i ampere, er det derfor anbefales at udføre små udtryk forsøg først for at identificere passende udtryk betingelser og pålideligheden af AMP aktivitet assay.
The authors have nothing to disclose.
J.H.N., T.B. og M.B. anerkende finansieringen af EU ‘s FW7 program (SYNPEPTIDE). F.-J.S. og T.F. anerkende finansieringen af det føderale ministerium for uddannelse og videnskab (BMBF Program “HSP 2020”, TU-WIMIplus projekt SynTUBio) og tyske Research Foundation (Cluster of Excellence “Unifying begreber i katalyse”).
sodium chloride | Carl Roth, Germany | P029 | |
guanidine hydrochloride | Carl Roth, Germany | 0035.2 | |
dipotassium hydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | P749.3 | |
potassium dihydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | 3904.3 | |
sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Carl Roth, Germany | K300.2 | |
disodium hydrogen phosphate | Carl Roth, Germany | P030.2 | |
L-alanine | Carl Roth, Germany | 3076.2 | |
L-arginine | Carl Roth, Germany | 3144.3 | |
L-asparagine monohydrate | Carl Roth, Germany | HN23.1 | |
L-aspartic acid | Carl Roth, Germany | T202.1 | |
L-cysteine | Carl Roth, Germany | 3467.3 | |
L-glutamine | Carl Roth, Germany | 3772.1 | |
L-glutamic acid | Carl Roth, Germany | 3774.1 | |
L-glycine | Carl Roth, Germany | 3187.3 | |
L-histidine | Carl Roth, Germany | 3852.3 | |
L-isoleucine | Carl Roth, Germany | 3922.3 | |
L-leucine | Carl Roth, Germany | 3984.3 | |
L-lysine monohydrate | Carl Roth, Germany | 4207.2 | |
L-methionine | Carl Roth, Germany | 9359.4 | |
L-phenylalanine | Carl Roth, Germany | 4491.2 | |
L-proline | Carl Roth, Germany | T205.3 | |
L-serine | Carl Roth, Germany | 4682.4 | |
L-threonine | Carl Roth, Germany | T206.2 | |
L-tryptophan | Carl Roth, Germany | 4858.2 | |
L-tyrosine | Carl Roth, Germany | T207.2 | |
L-valine | Carl Roth, Germany | 4879.4 | |
ammonium sulfate | Carl Roth, Germany | 3746.3 | |
magnesium sulfate | Carl Roth, Germany | 0261.2 | |
D-glucose | Carl Roth, Germany | 6780 | prepare a 20% (w/v) solution for addition into molten agar |
calcium chloride | Carl Roth, Germany | PN93.2 | |
iron(II) chloride | Sigma-Aldrich, Germany | 372870 | |
thiamine hydrochloride | Sigma-Aldrich, Germany | T1270 | |
biotin | Carl Roth, Germany | 3822.2 | |
copper(II) sulfate | Merck, Germany | 102792 | |
manganese(II) chloride | Carl Roth, Germany | KK36.2 | |
zinc chloride | Merck, Germany | 108816 | |
immonium orthomolybdate | Sigma-Aldrich, Germany | 277908 | |
glycerol | Carl Roth, Germany | 7533.3 | |
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich, Germany | I6758 | |
ampicillin sodium salt | Carl Roth, Germany | K029.5 | working concentration 100 µg/mL for E. coli, prepare 100 mg/mL stock in ddH2O |
kanamycin sulfate | Carl Roth, Germany | T832.2 | working concentration 50 µg/mL for E. coli, prepare 50 mg/mL stock in ddH2O |
chloramphenicol | Carl Roth, Germany | 3886.1 | working concentration 5 µg/mL for L. lactis, prepare 37 mg/mL stock in ethanol |
(4S)-fluoroproline | Bachem, Switzerland | F-3970 | |
(4R)-fluoroproline | Bachem, Switzerland | F-3975 | |
(4S)-hydroxyproline | Bachem, Switzerland | F-1395 | |
(4R)-hydroxyproline | Bachem, Switzerland | F-2980 | |
(4S)-methanoproline | chemically synthesized | ||
(4R)-methanoproline | chemically synthesized | ||
hydrochloric acid (HCl) | Carl Roth, Germany | P074.4 | |
ethanol | VWR, Germany | 20825.324 | |
M17-broth | Sigmal-Aldrich, Germany | 56156 | commercial product, see Terzaghi BE & Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 for contents and preparation |
agar-agar | Carl Roth, Germany | 5210.5 | |
Nisin from Lactococcus lactis | Sigma-Aldrich, Germany | N5764 | commercial product, can be used as reference for bioactivity |
dimethyl sulfoxide (DMSO) | Carl Roth, Germany | A994.1 | |
imidazole | Carl Roth, Germany | 3899.3 | |
1.5 mL autosampler vial for LC-MS | Sigma-Aldrich, Germany | Supelco 854165 | |
acetonitrile | VWR, Germany | HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642 | LC-MS grade required |
formic acid | VWR, Germany | HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865 | LC-MS grade required |
1 mL Ni-NTA IMAC column, e.g. HisTrap FF Crude | GE Healthcare, UK | 29-0486-31 | different manufacturers and resins available for IMAC |
0.45 µm bottle top filter unit | VWR, Germany | 10040-470 | sterile filtration of solutions using a vacuum pump |
0.45 µm syringe filter PVDF membrane | Carl Roth, Germany | CCY1.1 | sterile filtration of solutions using a syringe and to remove particles from cell lysates |
luer-lock syringe, PP, 50 ml | Carl Roth, Germany | T552.2 | sterile filtration of solutions |
1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf, Germany | 30120086 | |
petri dishes (polystyrene, sterile) | Carl Roth, Germany | TA19 | |
Nile red | Sigma-Aldrich, Germany | 72485 | |
E. coli ΔproA strain | CGSC, Keio collection | JW0233-2 | proline-auxotrophic E. coli K-12 strain |
E. coli B834(DE3) | Novagen (Merck), Germany | 69041 | methionine-auxotrophic E. coli B strain |
λDE3 Lysogenization Kit | Novagen (Merck), Germany | 69734-3 | |
Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT | bacterial indicator strain, see Khusainov R & Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890 | ||
benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes | Eppendorf, Germany | 5427 R | |
peristaltic pump | GE Healthcare, UK | P1 | |
FPLC system | GE Healthcare, UK | Äkta Purifier 10 or the like | |
inverted microscope | Nikon | TI Eclipse wide-field fluorescence microscope with 100x (N.A. 1.4) objective and Mercury Lamp | example setup for fluorescence microscopy |
electron multiplying CCD (EMCCD) camera | Andor Technologies, UK | Andor Luca | example setup for fluorescence microscopy |
fluorescence excitation filter | Thorlabs, USA | Dichroic cube (TLV-U-MF2-TRITC) | example setup for fluorescence microscopy |
fluorescence emission filter | AHF Analysentechnik, Germany | T 560 LPXR | example setup for fluorescence microscopy |
cover slip 24 x 60 mm | Carl Roth, Germany | LH26.1 | example setup for fluorescence microscopy |
Immersion Oil | Carl Zeiss, Germany | Immersol 518 F | example setup for fluorescence microscopy |
probe sonicator | Bandelin, Germany | Sonopuls HD3200 with sonotrode MS-72 | 200 W maximum HF output |
C5 HPLC column (2.1×100 mm, 3 µm particle size) | Sigma-Aldrich, Germany | 567227-U | example setup for mass spectrometry |
ESI-TOF coupled to HPLC system | Agilent, USA | Agilent 6530 Accurate Mass QTOF with 1260 HPLC | example setup for mass spectrometry |