Her give vi en demonstration af suge blister kutane hjemkalde model. Modellen giver mulighed for en let adgang til at studere menneskets i vivo adaptive immunrespons, for eksempel i forbindelse med vaccine udvikling.
Kutane antigen-hjemkalde modeller mulighed for undersøgelser af menneskelige hukommelse svar in vivo. Når det kombineres med hud suge blister (SB) induktion, tilbyder denne model tilgængelighed til sjældne populationer af antigen-specifikke T-celler repræsentant for den cellulære hukommelse svar samt cytokin mikromiljø i situ.
Denne rapport beskriver den praktiske procedure en kutan tilbagekaldelse, en SB induktion og en høst af antigen-specifikke T-celler. For at eksemplificere metoden, tuberkulin hudtest bruges til antigene tilbagekaldelse i personer, der forud for denne undersøgelse, undergik en Bacillus Calmette-Guérin vaccination mod en infektion med Mycobacterium tuberculosis. Endelig, eksempler på multiplex og flow cytometric analyser af SB prøver er angivet, illustrerer høj brøkdele af antigen-specifikke Polyfunktionelle CD4 + T-celler tilgængelige af denne prøveudtagningsmetode, sammenlignet med celler isoleret fra blodet.
Metoden beskrevet her er sikker og minimalt invasiv, giver en enestående mulighed for at studere både medfødte og adaptive immunrespons i vivo, og kan være til gavn for et bredt fællesskab af forskere, der arbejder med celle-medieret immunitet og menneskelige hukommelse svar, i forbindelse med vaccine udvikling.
En hud SB er et kunstigt induceret blister, der giver mulighed for høsten af celler og væske direkte fra huden. Teknik til at øge SBs af vakuum er et velkendt værktøj inden for dermatologi anvendes til undersøgelse af hud Immunologi i sundhed og sygdom1,2,3,4,5, 6 , 7 , 8. denne betænkning viser, hvordan den SB teknik kombineret med kutane antigene tilbagekaldelse (SB kutane hjemkalde metode) kan give direkte indsigt i adaptive immunrespons in vivo.
Princippet bag SB induktion er enkel: et lys vakuum er anvendt på et lille område af huden. Undertryk vil i sidste ende tvinge overhuden til at adskille fra dermis, at skabe en lokal blister fyldt med væske og celler1,2,9. Blister væske kan høstes ved en fin nål aspiration og indholdet kan bruges til yderligere undersøgelse i vitro.
I de seneste år har der været en stigende interesse i SB metode til undersøgelse af i vivo immunrespons end sygdomme begrænset til hud10,11. Undersøgelse af en adaptive immunitet hos mennesker er begrænset af det faktum, at celler og cytokiner af interesse er samplet fra perifert blod, fordi en invasiv prøvetagning af lymfeknude eller mave slimhinden væv kan være uacceptabelt og uetisk. Et eksempel er studiet af langlivede menneskelige memory T-celle svar efter vaccination12. I sådanne forsøg, prøveudtagning af relevante T-celler kan være en stor udfordring, fordi de relevante befolkning af celler, der mægle immunitet er bosat i den lymfoide væv, og kun et meget begrænset antal specifikke T-celler cirkulerer i det perifere blod.
SB teknik tilbyder en unik mulighed for at studere memory T-celler og andre specifikke cellepopulationer. Efter den kutane podning af antigen, T-celler specifikke til antigenet rekrutteres fra deres lymfoide hideaways på huden og kan nemt udtages fra SB. Programmerne metode og forskning af denne kutane hjemkalde model blev beskrevet af Akbar et al. i 20132. Et almindeligt anvendte antigen til huden tilbagekaldelse er kommercielt tilgængelige oprenset protein derivat (PPD) af mykobakterier bruges til at udføre en tuberkulin hudtest (TST)13, hvor PPD sprøjtes ind i de dermale lag af huden. Hos personer med en eksisterende immunologisk hukommelse mod PPD [fx, personer med en Mycobacterium tuberculosis (Mtb) infektion eller en forudgående Bacillus Calmette Guérin (BCG) vaccination], antigen deposition resulterer i en husker svar med migration til huden og en i vivo klonal ekspansion af PPD-specifikke CD4 + T-celler2,11,14,15. Som et resultat, høj brøkdele af PPD-specifikke Polyfunktionelle CD4 + T-celler ophobes i huden klar til SB prøveudtagning. T-celler indsamlet af denne metode har vist sig for at være robust og er tilstrækkeligt rigelige til være kendetegnet ved en række immunassays og en langsigtet i vitro kultur15. Således, den kutane hjemkalde model og SB induktion kan bevise en værdifuld metode til at studere i vivo T-celle svar af ex vivo analyser, og øget viden om denne fremgangsmåde kan gavne forskere med interesser i cellulære immunologi og vaccinologi.
Denne rapport indeholder den første trinvis vejledning i at fremkalde menneskelige hud suge blærer i PPD-indsprøjtning hud. Kutane antigen hjemkalde model er påvist ved hjælp af TST i BCG-vaccinerede frivillige. Endelig, den relevante ex vivo analyse af celler og cytokiner isoleret af SB er eksemplificeret. Phenotypical og funktionelle egenskaber for PPD-specifikke T-celler fremstillet ved metoden SB er grundigt beskrevet andetsteds2,10,11,16,17, 18 , 19. Formålet med denne betænkning at diskutere de praktiske og immunologiske aspekter af metoden til at lette anvendelsen af denne teknik med andre forskergrupper.
Dette manuskript beskriver en praktisk procedure for undersøgelse af human immun hukommelse svar i vivo, ved hjælp af kutane antigen hjemkalde og celle høst af suge blister induktion. TST blev brugt som et eksempel på intradermale antigen deposition og tilbagekaldelse af BCG-vaccine. Endelig, et eksempel på SB modellen karakterisering af cytometric og multiplex cytokin analyse var forudsat demonstrerer, at omtrent en tredjedel af SB celler blev antigen-specifikke Polyfunktionelle T-celler af effektor hukommelse fænotype.
Kritiske trin i denne protokol omfatter intradermal injektionsteknik, suge blister induktion og blister punktering. For det første kræver en korrekt intradermal deposition uddannet personale. En forkert deposition kan føre til suboptimale resultater. PPD er generelt en velkendt og sikker kutane antigen, men dens sammensætning kan variere mellem producenter, begrænser sammenligneligheden13,20. Denne rapport indeholder instruktioner for en enkelt intradermal aflejring af 2 TU, og eventuelt to parallelle depositioner (2 x 2 TU), som kan kræve yderligere etisk godkendelse. Men, andre undersøgelser har brugt 10 TU, som øger sandsynligheden for en stærk hud reaktion10,21. Under trinnet SB induktion vil små trinvis stigninger i undertryk reducere risikoen for blødning og blister brud. Risikoen for kontaminering med røde blodlegemer eller leukocytter fra blodbanen er generelt lav2. Aseptisk punktering teknik forhindrer mikrobiel kontaminering og at undgå kontakt mellem punktering nålen og dermal blister gulvet reducerer urenheder af snavs eller bosiddende hudceller. Men nogle forskere foretrækker at høste SB væske ved at anvende en rullende pres punkteret blister10. Det kan være nødvendigt at punktere septa i blister. SB-teknikken selv er minimalt invasiv; skjulte SBs helbrede uden ardannelse og infektioner er meget sjældne. 2 dog en vis grad af hypo-pigmentering kan forekomme og SB induktion bør formentlig undgås hos personer med en historie af kolloid ardannelse.
Tekniske begrænsninger omfatter lave samlede celle udbytter og dermed begrænsede muligheder for langtidsopbevaring. Relationer mellem leukocyt-udbyttet, kliniske TST svar, blister størrelse og erytrocyt forurening er blevet grundigt beskrevet andetsteds2,10. I BCG-hjemkalde eksperimenter præsenteres her (figur 1) var det mediane samlede udbytte fra hver blister 50.000, hvilket indebærer en mindre eksperimentel opsætning ved hjælp af disse celler, især hvis SBC’er er studerede alene15. Dog den specifikke T-celle population SB prøve, for det meste overstiger hvad der er fundet i PBMC prøver i både relative og absolutte celletal. I eksemplet præsenteres i figur 2, blev antallet af triple-positive PPD-specifikke T-celler i en stikprøve af 100.000 SB celler mere end 2 x større end det antal findes i 1 x 106 PBMC fra den samme donor (data ikke vist). En visuel scoring af TST reaktion er den mest almindelige kliniske metode til vurdering af M. tuberkulose hukommelse. Af note højdepunkt den underliggende adaptive immunologiske reaktion ikke på samme tid som klinisk hud reaktion2,21. Ikke alle BCG-vaccineret eller Mtb-udsatte personer vil udvikle stærk TST reaktioner og strategier for klassificering og en håndtering af prøver fra TST ikke-responders, samt en forudbestående mykobakterielle sensibilisering i befolkningens undersøgelse skal overvejes før indlede en tilbagekaldelse retssag ved hjælp af denne metode. Også, i både SB prøveudtagning og visuel scoring, der er et potentiale for en teoretisk skævhed i personer med reduceret hud svar på grund af globale eller hud-relaterede nedsat immunitet som set, eksempelvis i HIV-infektion og visse aldersgrupper2, 13,18,20. En immunologisk opreklamering af TST reaktion med gentagne afprøvning er derudover velkendt20,22. Men SB celle fænotyper stadig temmelig konstant, når TSTs er gentagne10. Denne observation understøtter rollen som SB tilbagekaldelse i longitudinelle studier af cellulære immunrespons.
For T-celle immunologists tillader SB hjemkalde høst af høj fraktioner af antigen-specifikke celler. Men timingen af SB for et udsnit fra en PPD-deposition er kritisk, da både den cellulære sammensætning og cytokin mikromiljø ændrer sig over tid. I denne protokol, vabler var induceret 7-dages post udfordring og de isolerede celler var primært effektor memory CD4 + T-celler herunder høj brøkdele af celler med et fælles udtryk af IFN-γ, TNF-α og IL-2. Disse konstateringer er i tråd med tidligere undersøgelser beskriver hvordan T-celle aktivering, spredning og differentiering sker i PPD-pulverlak huden2,15,21. Kinetic SB undersøgelser i PPD-sensibiliseret individer tyder på, at den meget tidlige hud reaktion er uspecifik; men allerede inden for de første dage efter PPD-udfordring, svaret bliver domineret af CD4 + T-celler (begge centrale hukommelse og effektor hukommelse fænotyper er blevet beskrevet) og, efter 3 dage, svaret er domineret af høje fraktioner af PPD-specifikke cytokin produktion af CD4 + T-celler2,8,10,15,21. Denne adaptive cytokin respons fortsat kan spores mere end 2 uger2,8,10,23. Dag 7 indlæg-TST synes at være den mest optimale tidspunkt for indsamling af cytokin produktion memory CD4 + T-celler2. Dog kan andre tidspunkter naturligvis være relevante afhængigt af antigen og svar af interesse. Bemærk, i en undersøgelse, er den adaptive PPD-svar blevet rapporteret at toppe lidt tidligere med et fald i pro-inflammatorisk cytokin sekretionen allerede på 5 dage post-TST10.
SB væske indeholder høje niveauer af både pro-inflammatoriske cytokiner og andre proteiner, vist sig at være repræsentant for hud mikromiljø15,24. Kinetik undersøgelser har vist, at TNF-α og IFN-γ niveauer i SB væske peak efter 3 dage, mens IL-2 niveauer peak efter 7 dage2,10, sandsynligvis afspejler dominans af adaptive responser på dette senere tidspunkt. Fordi SB celler har været aktiveret i vivo, udviser de en høj spontan cytokin frigivelse samt et potentiale for en bestemt overgang ved restimulering (figur 3 og 4).
Denne rapport fokuserer på CD4 + T-celle immunitet. Som vist i figur 2, faktisk var fleste af de isolerede T-celler CD4 +, mens der var næsten ingen CD8 + T-celler i suge blister væske. Dette er i overensstemmelse med andre SB PPD-hjemkalde undersøgelser rapportering lav proportioner og en ringere vandrende kapacitet af CD8 + T-celler i forhold til CD4 + T celler2,8,10,23. En yderligere karakterisering af CD8 + bidrag ville være at foretrække; Dette er dog uden for rammerne af denne betænkning.
T-celler betragtes som væsentlige til immun kontrol af Mtb; Det har imidlertid været svært at identificere en pålidelig korrelat beskyttelsens afspejles i den adaptive immunrespons fra blod25,26. Denne vejspærring hindrer alvorligt udviklingen af nye TB vaccine, som i øjeblikket er der ikke noget alternativ til store og meget kostbare effektivitet forsøg27. TB vaccine udviklere bestemme vaccine immunogenicitet ved vurderingen af små og forbigående ændringer i vaccine-specifikke T-celle populationer i blod28,29. Det er dog tvivlsomt, om den lille brøkdel af cirkulerende antigen-specifikke T-celler i blodet er relevant (dvs., i stand til at migrere til stedet af en infektion og repræsentant for T-celle-rige mikromiljø kontrollerende Mtb) 27 , 30 , 31 .
Baseret på tidligere undersøgelser og data præsenteres heri, repræsenterer SB kutane hjemkalde model et uudnyttet potentiale for studier af vaccine-specifikke T-celler. Ikke alene giver modellen en tilbagekaldelse af en vaccine respons genereret årtier siden, det giver også en evaluering af den sande hukommelse potentiale i et væv-specifikke kontekst15,18,19,21. Roman, specifikke hudprøver, som omfatter antigener også består af kandidat subunit TB vacciner, foreslå nye muligheder for vaccine evaluering ved hjælp af denne model28,32. Desuden transkriptom analyser tyder på, at en celle – mediated immunrespons genereret i PPD-udfordret hud er magen til svar findes i Mtb-smittede lunge18.
Mens huden punch biopsier også give mulighed for en celle høst fra huden og give geografisk information, sammenlignet med SB prøvetagning, metoden er mere invasive og kræver enzymatiske eller mekanisk forarbejdning at forberede encellede suspensioner33. Målinger af cytokiner og celle markører kan sammenlignes mellem to metoder2,10.
Metoden suge blister er allerede blevet anvendt i mange områder af medicinsk forskning udover dermatologi, enten alene eller i kombination med en systemiske eller lokale hud udfordring. Eksempler er studier af sepsis, Epstein – Barr virus-associerede Lymfoproliferative sygdom, diabetisk neuropati, glukokortikoid indtag effekter og humane forsøg test terapeutiske antistoffer eller modeller for T-celle-målrettede behandlinger10 ,34,35,36,37,38.
Fra et terapeutisk synspunkt SB kutane hjemkalde metode giver enestående fordele for at studere den centrale T-celle hukommelse potentielle og -fra både biologiske og teknisk synspunkt-huden synes at give en relevant prøveudtagning rum2, 15,18,19,21. Især i forhold til traditionelle, passive prøveudtagning af cirkulerende PBMC, SB kutane hjemkalde metode giver mulighed for undersøgelse af T-celler, der har vist evnen til at migrere fra lymfeknude som svar på deres relevante antigen, og komplet lokalt udvidelse og differentiering i et væv-specifikke i vivo sammenhæng15,18,19,21.
Afslutningsvis viste model her kunne være relevant for forskere inden for menneskelige adaptive immunitet og T-celle målretning agenter (dvs., i smitsomme sygdomme vaccinologi eller kræft forskning). TST model anvendt i denne protokol er naturligvis af særlig relevans inden for TB vaccinologi. Men det grundlæggende koncept i denne model er stærkt gældende i andre områder inden for forskning.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Mads Radmer Jensen for sit praktiske og akademiske råd; Lau Lindqvist og Kaare Svejstrup for at yde teknisk ekspertise; Helene Bæk Juel, Jonathan Filskov, Signe T. Schmidt og Solveig W. Harpøth for deres tekniske bistand; Personalet på Gentofte TB ambulatorium for deres uddannelse i PPD-administration; og alle frivillige til at deltage i undersøgelsen. Dette projekt er finansieret af Europa Kommissionens H2020 program [grant nummer TBVAC2020 643381], og vi vil gerne takke konsortiets partnere for de givtige drøftelser.
Gloves for laboratory use | Imtex, Denmark | 1013 | |
Desinfection spray | Apotek, Denmark | 82% alcohol, with glycerin, for human skin | |
Alcohol swaps | Mediq, Denmark | 1131892 | |
PPD RT 23 "SSI" (2 T.U./0.1ml) | AJ Vaccines | ||
Myjector syringe with fixed needle | Terumo | A236 | 1 ml/29G/12mm |
Ruler | not relevant | for skin reaction evaluation | |
Ballpoint pen | not relevant | for skin reaction evaluation | |
Portable Lung Suction Unit | Laerdal Medical, Denmark | 78000011 | NOTE. Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital |
Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | ||
Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | ||
Negative Pressure Instrument Seal Kit | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | ||
Negative pressure Chamber Strap | Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA | 12 inches | |
Micropore Surgical tape | 3M | 1533-1 | 2.5cm x 9.1m |
Cap from 15ml plastic tube | Sarstedt, Germany | 62,547,254 | |
Tubigrip bandage | Mölnlycke Health Care, Sweden | 1443 | |
Cosmopor steril adhesive dressing | Hartmann | 9008337 | 7.2 x 5 cm |
2ml Syringe Concentric Luer Slip | Becton Dickinson | 300185 | |
Microlance 23G/30mm needle | Becton Dickinson | 300700 | |
Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved) | Eppendorf | 0030120086 | Autoclaved |
Minispin plus centrifuge | Eppendorf | 5453000011 | |
Gibco AIM V Medium | Life Technologies | 12055-091 |