誘導多能性幹細胞由来肝細胞を用いた家族性高コレステロール血症ひと肝臓キメラマウス モデル
Summary
ここでは、ひと誘導多能性幹細胞由来肝細胞を用いた家族性高コレステロール血症のひと肝臓キメラマウス モデルを生成するためのプロトコルを提案する.高コレステロール血症の新しい治療法をテストするための貴重なモデルです。
Abstract
家族性高コレステロール血症 (FH) 主因は低比重リポ蛋白受容体 (来す) 突然変異によって、血液中の LDL コレステロール (LDL-C) のマーク付きの上昇のための早期発症心血管疾患のリスクが増加します。スタチン系薬剤は FH と他の種類、高コレステロール血症の治療のための脂質低下薬の最初の行が、新しいアプローチで浮上している、今臨床試験でテストされている特定の PCSK9 抗体。FH、新しい薬や新しい製剤の新しい治療法を探索するには、は、体内モデル適切な必要があります。しかし、人間と比較して脂質代謝の違いは FH.の利用可能な動物モデルの重要な問題この問題に対処するための FH の誘導多能性幹細胞 (iPSC) を用いたひと肝臓キメラマウス モデルを生成-肝細胞 (iHeps) を派生しました。我々 は、移植されたひと細胞の免疫拒絶反応を回避して来すの効果を評価するために/来す-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) マウスを使用-を来すの欠乏 iHeps null 背景。移植の FH iHeps アルブミン染色に基づいて LRG マウス肝臓の 5-10% を再作成します。また、明らかな移植 iHeps は脂質低下薬に応答し、スタチン系薬剤と比較して PCSK9 抗体の効果の臨床的観察を締めくくっています。私たち人間の肝臓のキメラ モデル従って FH に新しい治療法の臨床試験の役に立つかもしれない。他の FH の遺伝子変異やその他の継承された肝疾患に対応する突然変異の同じプロトコル、類似したひと肝臓キメラマウスを使用しても生成される可能性があります。
Introduction
低比重リポ蛋白受容体 (来す) は、肝臓でのコレステロールの合成を調節する血中 LDL コレステロール (LDL-C) をキャプチャします。来す遺伝子の変異は、家族性高コレステロール血症 (FH)1の最も頻繁な原因です。スタチン系薬剤は伝統的に FH と高コレステロール血症 (継承または取得) の他のタイプの治療に薬の最初の行をされています。スタチン系薬剤は、3-ヒドロキシ-3-methylglutaryl-補酵素2の肝臓のコレステロール合成を下げる還元酵素を阻害します。さらに、スタチン系薬剤は、血漿 LDL-C のクリアランスを促進するために肝細胞表面を来すレベルを上げます。しかし、スタチンによる治療の主な注意点は、同時にするプロタンパク質転換酵素サチライシン/禾欣 9 (PCSK9) を来すにその劣化3を促進するために結合する酵素の発現を誘導することです。この効果は多くの患者にみられるスタチンに不十分またはも null 応答を担当です。このメカニズムを勉強しては、高コレステロール血症を治療する別の方法の発見につながっている、予期せず。PCSK9 抗体最近の FDA によって承認された臨床試験で現在使用されている、高い治療効果を示し、スタチン4より優れた耐久。PCSK9 抗体の成功はまた、高コレステロール血症患者における (PCSK9) 以外を来す分解経路を調節する他の治療上の可能性があることを意味します。同様に、PCSK9 抗体、たとえば、siRNA oligos5以外新規阻害剤の開発に関心があります。
FH と高コレステロール血症の一般的なその他の種類の新しい治療法をテストするため生体内で適切なモデルが必要です。現在生体内での主要な問題のモデルは、ほとんどマウス6と7、ウサギ人間との生理学的な相違点は。重大に、これらの問題は、異なる脂質代謝プロファイルを含みます。ひと肝キメラ動物8世代この注意点を克服するために役立つかもしれない。ひと肝臓キメラマウスは、ひと肝細胞、たとえば、プライマリひと肝細胞 (pHH)9の肝「ヒト」のマウスの一種です。PHH の問題はすぐに拡大されたex vivoをすることはできません限られたソースは、分離時にその機能を失います。PHH に代わる誘導多能性幹細胞 (iPSC) の使用である-肝細胞 (iHeps)10を派生しました。特に、Ips は患者固有であり、オンデマンドで新鮮な pHH 上重要な利点である iHeps を作り出すことができるので、いつまでも育てることができます。また、どの Ips も、デザイナーの核酸を修正したりより忠実な比較11ように同質遺伝子背景の突然変異を導入すると簡単に遺伝子組み換えできますでまた。
明らかな移植 pHH とひと肝臓キメラマウスは、肝臓の代謝プロファイル、薬物応答と肝炎ウイルス感染12薬剤感受性の人間に類似点を示します。これは生体内で高脂血症を勉強する良いモデルをさせます。最も広く使用されているマウス モデルは、 Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (ドイツ連邦共和国) のマウス13と uPA トランスジェニック マウス8、pHH によってマウスの 95% まで肝臓を置き換えることができますに基づいています。興味深いことに、最近の報告書は、人間 FH 肝臓キメラマウス (ドイツ連邦共和国のマウスに基づく) ホモを来す変異14を運ぶ患者から pHH とを説明します。このモデルで再作成されるひと肝細胞が機能を来すをなかったが、残留マウス肝細胞は、生体内で薬を来す経路依存のテストを実行するためのユーティリティを減らします。
を来す-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) マウス肝臓に FH iHeps を接がの最近出版された仕事15に基づく詳細なプロトコルを報告する.このひと肝臓キメラマウスは FH をモデリングおよび薬剤のテストの実行に役立つ体内。
Protocol
Representative Results
Discussion
齧歯動物で iHeps を使った過去の研究は、彼らが継承された肝疾患17を研究する効果的な方法を確認しました。さらにこの技術の使用を拡大し、現在 FH 動物モデルは最適ではないので、LRG マウスに FH iHeps にしみ込んで明らかな移植を来す± またはヘテロ接合体を来すことを示した-変異 FH iHeps マウス血漿 LDL-C を減らすことができます生体内で薬の脂質低?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、深セン科学技術評議会基礎研究プログラム (JCYJ20150331142757383)、中国科学 (XDA16030502)、香港研究助成協議会テーマに基づいて研究院の戦略的な重点研究課題に支えられスキーム (T12-705/11)、香港特別行政区協議会研究助成金およびチーム プロジェクト広東省自然科学 (N-HKU730/12 と 81261160506) 研究中国の国家自然科学基金の協力プログラム財団 (2014A030312001)、広州技術プログラム (201607010086) と広東省科学技術プログラム (2016B030229007 および 2017B050506007)。
Materials
| Materials | |||
| 40 µm Cell strainer | BD | B4-VW-352340 | |
| 6-Well plate | Thermofisher | 140675 | Extracellular matrix coated |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | Dissolve in water |
| Antigen retrieval solution | IHC World | IW-1100-1L | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C8106 | CaCl2 |
| Cell dissociation enzyme | Thermofisher | 12604-013 | TrypLE |
| D-glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D5879 | DMSO |
| DMEM | Thermofisher | 10829 | Knockout DMEM |
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| EDTA | USB | 15694 | 0.5 M, PH=8.0 |
| Extracellular matrix (for cell suspension) | Corning | 354234 | Matrigel |
| Extracellular matrix (for iHep differentiation) | Corning | 354230 | Matrigel |
| Hepatocyte basal medium | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte culture medium | Lonza | CC-3198 | |
| High-fat and high-cholesterol diet | Research Diet | D12079B | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human hepatocyte growth factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human iPSC maintenance medium | STEMCELL Technologies | 5850 | mTeSR1 |
| Human oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Ketamine 10% | Alfasan | N/A | |
| L-glutamine | Thermofisher | 35050 | |
| LDL-C detection kit | WAKO | 993-00404 and 993-00504 | |
| Magnesium chloride | VWR | P25108 | MgCl2 |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | NADA 141-213 | |
| Monopotassium phosphate | USB | S20227 | KH2PO4 |
| Non-essential amino acids | Thermofisher | 11140 | |
| PBS | GE | SH30256.02 | Calcium and magnesium-free |
| PCSK9 antibodies | Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals | SAR236553/REGN727 | Alirocumab |
| Phenobarbital | Alfamedic company | 013003 | |
| Phenylephrine | RBI | P-133 | Dissolve in water |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | KCl |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Betadine | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Sigma Aldrich | Y0503-5MG | |
| RPMI 1640 | Thermofisher | 21875 | |
| Serum replacement | Thermofisher | 10828 | |
| Silicone coated petri dish | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme | ZOCOR | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | NaCl |
| Trypan blue solution 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| U-46619 | Cayman | 16450 | Dissolve in DMSO |
| Xylazine 2% | Alfasan | N/A | |
| β-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| AAT | DAKO | A0012 | 1:400 |
| ALB | Bethyl Laboratories | A80-129 | 1:200 |
| ASGPR | Santa Cruz | Sc-28977 | 1:100 |
| HNF4A | Santa Cruz | Sc-6557 | 1:35 |
| NANOG | Stemgent | 09-0020 | 1:200 |
| OCT4 | Stemgent | 09-0023 | 1:200 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Il2rg-/- | Jacson lab | 003174 | |
| Ldlr-/- | Jacson lab | 002077 | |
| Rag2-/- | Jacson lab | 008449 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess | |
| Gamma irradiator | MDS Nordion | Gammacell 3000 Elan II | |
| Insulin syringe | BD | 324911 | |
| Powerlab | ADInstruments | Model 8/30 | |
| Slides scanning system | Leica biosystems | Aperio scanScope system | |
| Sliding Microtome | Leica biosystems | RM2125RT | |
| Stereomicrocope | Nikon | SMZ800 | |
| Tissue processing system | Leica biosystems | ASP200S | |
| Wire myograph | DMT | 610M | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Digital slide viewing software | Leica | Aperio ImageScope Version 12.3.2 | |
| Image J | NIH | Version 1.51e | |
| Image processing software | Adobe | Photoshop CC Version 2015 | |
| Microscope imaging software | Carl Zeiss | AxioVision LE Version 4.7 |
Referências
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
- Endo, A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors. J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).
- Dubuc, G., et al. Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia. Arterioscler Thrombo Vasc Biol. 24 (8), 1454-1459 (2004).
- Robinson, J. G., et al. Efficacy and safety of alirocumab in reducing lipids and cardiovascular events. N Engl J Med. 372 (16), 1489-1499 (2015).
- Fitzgerald, K., et al. Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial. Lancet. 383 (9911), 60-68 (2014).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. J Clin Invest. 92 (2), 883-893 (1993).
- Watanabe, Y. Serial inbreeding of rabbits with hereditary hyperlipidemia (WHHL-rabbit). Atherosclerosis. 36 (2), 261-268 (1980).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. J Clin Invest. 124 (11), 4953-4964 (2014).
- Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol. 165 (3), 901-912 (2004).
- Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
- Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
- Bissig, K. D., et al. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment. J Clin Invest. 120 (3), 924-930 (2010).
- Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice. Nat Biotechnol. 25 (8), 903-910 (2007).
- Bissig-Choisat, B., et al. Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model. Nat Commun. 6, 7339 (2015).
- Yang, J., et al. Generation of human liver chimeric mice with hepatocytes from familial hypercholesterolemia induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 8 (3), 605-618 (2017).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Chen, Y., et al. Amelioration of hyperbilirubinemia in gunn rats after transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Stem Cell Rep. 5 (1), 22-30 (2015).
- Ortmann, D., Vallier, L. Variability of human pluripotent stem cell lines. Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).
- Liu, H., Kim, Y., Sharkis, S., Marchionni, L., Jang, Y. Y. In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins. Sci Transl Med. 3 (82), 82ra39 (2011).
