מודל אנושי העכבר Chimeric הכבד היפרכולסטרולמיה משפחתית באמצעות Hepatocytes נגזר תאי גזע Pluripotent המושרה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת מודל אנושי העכבר chimeric הכבד של היפרכולסטרולמיה משפחתית באמצעות hepatocytes נגזר תאי גזע pluripotent המושרה אנושי. זהו מודל ערך בדיקה טיפולים חדשים עבור היפרכולסטרולמיה.
Abstract
היפרכולסטרולמיה משפחתית (FH) נגרמת בעיקר על ידי מוטציות קולטן (LDLR) ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה ותוצאות סיכון מוגבר למחלות לב וכלי דם התפתחות מוקדמת עקב העלאת מסומן של כולסטרול LDL (LDL-C) בדם. סטטינים הן הקו הראשון של התרופות להורדת שומנים בדם לטיפול FH וסוגים אחרים של היפרכולסטרולמיה, אבל גישות חדשות מתגלים, בנוגדנים PCSK9 מסוים, כעת נבדקות בניסויים קליניים. לחקור את רומן גישות טיפוליות עבור FH, תרופות חדשות או ניסוחים חדשים, אנחנו צריכים מתאים ויוו מודלים. עם זאת, הבדלים פרופילי השומנים מטבולית לעומת בני אדם הם בעיה מפתח של מודלים בבעלי חיים הזמינים של FH. כדי לטפל בבעיה זו, יש לנו שנוצר דגם העכבר chimeric הכבד האנושי באמצעות תאי גזע pluripotent FH המושרה (iPSC)-נגזר hepatocytes (iHeps). השתמשנו עכברים/Ldlr– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (LRG) כדי למנוע דחיית החיסון של התאים המושתלים של האדם וכדי להעריך את ההשפעה של LDLR-iHeps חסר ב- LDLR null רקע. IHeps FH המושתלים יכול לאכלס 5-10% של הכבד העכבר LRG בהתבסס על אנושי אלבומין מכתים. יתר על כן, iHeps engrafted הגיב לתרופות להורדת שומנים בדם, recapitulated תצפיות קליניות של יעילות מוגברת של נוגדנים PCSK9 בהשוואה סטטינים. המודל chimeric הכבד האנושי שלנו ובכך יכול להיות שימושי לניסויים פרה של טיפולים חדשים כדי FH. שימוש באותו פרוטוקול, דומה עכברים chimeric הכבד האנושי FH וריאציות גנטיות אחרות, או מוטציות המתאימים למחלות כבד בירושה, ייתכן גם שיופקו.
Introduction
קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDLR) לוכדת LDL הכולסטרול (LDL-C) בדם לווסת סינתזה כולסטרול בכבד. מוטציות בגן LDLR הם הגורם השכיח ביותר של היפרכולסטרולמיה משפחתית (FH)1. סטטינים היו באופן מסורתי השורה הראשונה של תרופות לטיפול FH וסוגים אחרים של היפרכולסטרולמיה (תורשתית או נרכש). סטטינים מעכבים 3-הידרוקסי-3-methylglutaryl-קואנזים רדוקטאז להורדת כולסטרול סינתזה בכבד2. בנוסף, סטטינים להגביר את רמות LDLR על פני hepatocyte לקדם פלזמה סיווג LDL-C. אולם, אזהרה העיקריים של הטיפול עם סטטינים היא כי הם בו זמנית זירוז הביטוי של proprotein convertase סבטיליזין/hexin 9 (PCSK9), אנזים זה נקשר LDLR לקדם השפלה3. אפקט זה הוא אחראי על התגובה לא מספיקות או אפילו null סטטינים אצל חולים רבים. לומד מנגנון זה, באופן בלתי צפוי, הוביל הגילוי של דרך חלופית לטיפול היפרכולסטרולמיה. נוגדנים PCSK9 לאחרונה אושרה על ידי ה-FDA כרגע בשימוש במחקרים קליניים ולהראות יעילות גבוהה וסובלנות טוב יותר מאשר סטטינים4. ההצלחה של נוגדנים PCSK9 מרמזת כי ייתכן אפשרויות טיפוליות אחרות לווסת את המעבר השפלה LDLR (חוץ PCSK9) בחולים עם היפרכולסטרולמיה. באופן דומה, יש עניין בפיתוח מעכבי החדש של PCSK9 שאינם נוגדנים, לדוגמה, siRNA oligos5.
כדי לבדוק טיפולים חדשים עבור FH וסוג באופן כללי אחרים של היפרכולסטרולמיה, מודלים המתאימים ויוו נחוצים. אחת הבעיות המרכזיות של הנוכחי אין ויוו מודלים, בעיקר עכברים6 , ארנבונים7, הבדלים פיזיולוגיים שלהם עם בני אדם. ויותר חשוב, בעיות אלה כוללות פרופיל מטבולי שונה השומנים. הדור של חיות chimeric הכבד האנושי8 עשוי לעזור להתגבר על זה אזהרה. העכבר chimeric הכבד האנושי הוא סוג של עכבר “humanized” בכבד אוכלס מחדש עם hepatocytes אנושי, לדוגמה, hepatocytes אנושי ראשוני (pHH)9. בעיה עם pHH היא שהם לא יכולים להיות מורחב vivo לשעבר, במהירות לאבד את תפקידם על בידוד, והם מקור מוגבל. אלטרנטיבה pHH הוא השימוש בתאי גזע pluripotent מושרה (iPSC)-נגזר hepatocytes (iHeps)10. ראוי לציין, iPSCs החולה הספציפי, ניתן לגדל ללא הגבלת זמן, כך iHeps יכול להיות מיוצר לפי דרישה, המהווה יתרון משמעותי על פני pHH טריים. יתר על כן, iPSCs יכול גם להיות בקלות מהונדסים גנטית עם מעצבים nucleases לתיקון או להציג מוטציות בגן רקע isogenic כדי לאפשר השוואות נאמן יותר11.
עכבר chimeric הכבד האנושי עם engrafted pHH להראות דמיון לבני פרופילים מטבולי בכבד, תגובות סמים, ואת הרגישות זיהום וירוס הפטיטיס12. זה הופך אותם מודל לימודים היפרליפידמיה ויוו. הדגמים העכבר הנפוצה ביותר מבוססים על/Fah– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (FRG) העכבר13 ו את uPA העכבר הטרנסגניים8, באיזה עד 95% של העכבר הכבד יכולים להיות מוחלפים על-ידי pHH. מעניין, דו ח זה התבצעה תיאר אדם FH כבד chimeric (מבוסס על העכבר FRG) עם העכבר pHH מחולה נושא מוטציה LDLR homozygous14. במודל זה, hepatocytes האנושי הנידונה לא LDLR פונקציונלי, אבל hepatocytes העכבר שיורית, ובכך להקטין את תוכנית השירות לביצוע ויוו בדיקות סמים להסתמך על מסלול LDLR.
כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט המבוסס על שלנו העבודה שפורסמו לאחרונה15 עבור engrafting FH iHeps לתוך הכבד העכבר/Ldlr– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (LRG). העכבר chimeric הכבד האנושי הזה הוא שימושי עבור מידול FH וביצוע בדיקות סמים ויוו.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקרים קודמים באמצעות iHeps ב מכרסמים אישרו כי הם דרך יעילה ללמוד בירושה מחלות כבד17. בכדי להרחיב את השימוש בטכנולוגיה זו, כי המודלים הנוכחיים של בעלי חיים FH שיוצרת, אנו engrafted FH iHeps לתוך עכברים LRG, הראה כי את engrafted LDLR + /- או משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים LDLR-iHeps FH מוטציה יכ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המדע שנג’ן טכנולוגיה מועצת המחקר התוכנית הבסיסית (JCYJ20150331142757383), תכנית המחקר עדיפות אסטרטגית של האקדמיה הסינית למדעים (XDA16030502), הונג קונג מחקר המועצה מענק דירוג המבוסס על מחקר ערכת (טי12-705/11), תוכנית משותפת של המועצה מענקים למחקר של האזור המנהלי המיוחד הונג קונג ושל קרן מדעי הטבע הלאומית של סין (N-HKU730/12 ו- 81261160506), צוות פרוייקט מחקר מדעי הטבע גואנג-דונג קרן (2014A030312001), גואנגג’ואו המדע, הטכנולוגיה התוכנית (201607010086), בפרובינצית גואנג-דונג מדע, טכנולוגיה תוכנית (2016B030229007 ו- 2017B050506007).
Materials
| Materials | |||
| 40 µm Cell strainer | BD | B4-VW-352340 | |
| 6-Well plate | Thermofisher | 140675 | Extracellular matrix coated |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | Dissolve in water |
| Antigen retrieval solution | IHC World | IW-1100-1L | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C8106 | CaCl2 |
| Cell dissociation enzyme | Thermofisher | 12604-013 | TrypLE |
| D-glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D5879 | DMSO |
| DMEM | Thermofisher | 10829 | Knockout DMEM |
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| EDTA | USB | 15694 | 0.5 M, PH=8.0 |
| Extracellular matrix (for cell suspension) | Corning | 354234 | Matrigel |
| Extracellular matrix (for iHep differentiation) | Corning | 354230 | Matrigel |
| Hepatocyte basal medium | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte culture medium | Lonza | CC-3198 | |
| High-fat and high-cholesterol diet | Research Diet | D12079B | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human hepatocyte growth factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human iPSC maintenance medium | STEMCELL Technologies | 5850 | mTeSR1 |
| Human oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Ketamine 10% | Alfasan | N/A | |
| L-glutamine | Thermofisher | 35050 | |
| LDL-C detection kit | WAKO | 993-00404 and 993-00504 | |
| Magnesium chloride | VWR | P25108 | MgCl2 |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | NADA 141-213 | |
| Monopotassium phosphate | USB | S20227 | KH2PO4 |
| Non-essential amino acids | Thermofisher | 11140 | |
| PBS | GE | SH30256.02 | Calcium and magnesium-free |
| PCSK9 antibodies | Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals | SAR236553/REGN727 | Alirocumab |
| Phenobarbital | Alfamedic company | 013003 | |
| Phenylephrine | RBI | P-133 | Dissolve in water |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | KCl |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Betadine | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Sigma Aldrich | Y0503-5MG | |
| RPMI 1640 | Thermofisher | 21875 | |
| Serum replacement | Thermofisher | 10828 | |
| Silicone coated petri dish | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme | ZOCOR | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | NaCl |
| Trypan blue solution 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| U-46619 | Cayman | 16450 | Dissolve in DMSO |
| Xylazine 2% | Alfasan | N/A | |
| β-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| AAT | DAKO | A0012 | 1:400 |
| ALB | Bethyl Laboratories | A80-129 | 1:200 |
| ASGPR | Santa Cruz | Sc-28977 | 1:100 |
| HNF4A | Santa Cruz | Sc-6557 | 1:35 |
| NANOG | Stemgent | 09-0020 | 1:200 |
| OCT4 | Stemgent | 09-0023 | 1:200 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Il2rg-/- | Jacson lab | 003174 | |
| Ldlr-/- | Jacson lab | 002077 | |
| Rag2-/- | Jacson lab | 008449 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess | |
| Gamma irradiator | MDS Nordion | Gammacell 3000 Elan II | |
| Insulin syringe | BD | 324911 | |
| Powerlab | ADInstruments | Model 8/30 | |
| Slides scanning system | Leica biosystems | Aperio scanScope system | |
| Sliding Microtome | Leica biosystems | RM2125RT | |
| Stereomicrocope | Nikon | SMZ800 | |
| Tissue processing system | Leica biosystems | ASP200S | |
| Wire myograph | DMT | 610M | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Digital slide viewing software | Leica | Aperio ImageScope Version 12.3.2 | |
| Image J | NIH | Version 1.51e | |
| Image processing software | Adobe | Photoshop CC Version 2015 | |
| Microscope imaging software | Carl Zeiss | AxioVision LE Version 4.7 |
Referências
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
- Endo, A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors. J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).
- Dubuc, G., et al. Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia. Arterioscler Thrombo Vasc Biol. 24 (8), 1454-1459 (2004).
- Robinson, J. G., et al. Efficacy and safety of alirocumab in reducing lipids and cardiovascular events. N Engl J Med. 372 (16), 1489-1499 (2015).
- Fitzgerald, K., et al. Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial. Lancet. 383 (9911), 60-68 (2014).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. J Clin Invest. 92 (2), 883-893 (1993).
- Watanabe, Y. Serial inbreeding of rabbits with hereditary hyperlipidemia (WHHL-rabbit). Atherosclerosis. 36 (2), 261-268 (1980).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. J Clin Invest. 124 (11), 4953-4964 (2014).
- Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol. 165 (3), 901-912 (2004).
- Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
- Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
- Bissig, K. D., et al. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment. J Clin Invest. 120 (3), 924-930 (2010).
- Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice. Nat Biotechnol. 25 (8), 903-910 (2007).
- Bissig-Choisat, B., et al. Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model. Nat Commun. 6, 7339 (2015).
- Yang, J., et al. Generation of human liver chimeric mice with hepatocytes from familial hypercholesterolemia induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 8 (3), 605-618 (2017).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Chen, Y., et al. Amelioration of hyperbilirubinemia in gunn rats after transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Stem Cell Rep. 5 (1), 22-30 (2015).
- Ortmann, D., Vallier, L. Variability of human pluripotent stem cell lines. Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).
- Liu, H., Kim, Y., Sharkis, S., Marchionni, L., Jang, Y. Y. In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins. Sci Transl Med. 3 (82), 82ra39 (2011).
