En familjär hyperkolesterolemi mänskliga levern chimär musmodell med inducerade pluripotenta stamceller-derived hepatocyter
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att generera en människa lever chimära musmodell av familjär hyperkolesterolemi med mänskliga inducerade pluripotenta stamceller-derived hepatocyter. Detta är en värdefull modell för att testa nya terapier för hyperkolesterolemi.
Abstract
Familjär hyperkolesterolemi (FH) är oftast orsakas av LDL-receptorn (Receptorn) mutationer och resulterar i en ökad risk för tidig debut hjärt-kärlsjukdom på grund av markant förhöjda LDL kolesterol (LDL-C) i blodet. Statiner är den första raden av lipidsänkande läkemedel för att behandla FH och andra typer av hyperkolesterolemi, men nya metoder växer fram, i särskilt PCSK9-antikroppar, som nu testas i kliniska prövningar. För att utforska nya terapeutiska metoder för FH, antingen nya läkemedel eller nya formuleringar, behöver vi lämpliga i vivo modeller. Skillnader i de metaboliska lipidprofiler jämfört med människor är dock ett nyckelproblem för de tillgängliga djurmodeller av FH. För att lösa problemet, vi har genererat en människa lever chimära musmodell med FH inducerade pluripotenta stamceller (iPSC)-härledda hepatocyter (iHeps). Vi använde/receptorn– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (LRG) möss att undvika immun avstötning av transplanterade mänskliga celler och bedöma effekten av Receptorn-bristfällig iHeps i en Receptorn null bakgrund. Transplanterade FH iHeps kunde återbefolka 5-10% av LRG mus levern baserat på humant albumin färgning. Dessutom den engrafted iHeps svarat på lipidsänkande läkemedel och återgetts kliniska observationer av ökad effekt av PCSK9 antikroppar jämfört med statiner. Vår mänskliga levern chimära modell kan således vara användbar för preklinisk testning av nya terapier för FH. Med hjälp av samma protokoll, liknande mänskliga levern chimära möss för andra FH genetiska varianter eller mutationer som motsvarar andra ärftliga leversjukdomar, kan också genereras.
Introduction
LDL-receptorn (Receptorn) fångar LDL-kolesterol (LDL-C) i blod att modulera syntesen av kolesterol i levern. Mutationer i Receptorn gen är den vanligaste orsaken till familjär hyperkolesterolemi (FH)1. Statiner har traditionellt varit den första raden i medicin för att behandla FH och andra typer av hyperkolesterolemi (ärvda eller förvärvade). Statiner hämmar 3-hydroxi-3-methylglutaryl-coenzym en reduktas till lägre kolesterolsyntes i levern2. Dessutom ökar statiner Receptorn nivåer på hepatocyte ytan att främja plasma LDL-C clearance. En stor varning för behandling med statiner är dock att de samtidigt inducerar uttryck av proprotein convertase subtilisin/hexin 9 (PCSK9), ett enzym som binder till Receptorn för att främja dess nedbrytning3. Denna effekt är ansvarar för otillräcklig eller ens null svar till statiner hos många patienter. Studera denna mekanism har oväntat lett till upptäckten av ett alternativt sätt att behandla hyperkolesterolemi. PCSK9-antikroppar som nyligen godkändes av FDA används för närvarande i kliniska prövningar och Visa högre effekt och bättre tolerans än statiner4. Framgången av PCSK9 antikroppar innebär också att det kan finnas andra terapeutiska möjligheter att differentiera den Receptorn nedbrytningsvägen (förutom PCSK9) hos patienter med hyperkolesterolemi. Likaså finns det intresse att utveckla nya hämmare av PCSK9 än antikroppar, exempelvis siRNA oligos5.
För att testa nya behandlingar för FH och i allmänhet någon annan typ av hyperkolesterolemi, är lämpligt i vivo modeller nödvändigt. Ett stort problem för nuvarande i vivo modeller, mestadels möss6 och kaniner7, deras fysiologiska skillnader med människor. Dessa problem inkluderar avgörande, en olika metaboliska lipidprofilen. Generering av mänskliga levern chimära djur8 kan bidra till att övervinna denna varning. Den mänskliga leverskada chimär mus är en typ av ”humaniserad” mus med dess levern nyinsatta med humana hepatocyter, exempelvis primära humana hepatocyter (pHH)9. Ett problem med pHH är att de inte kan utökad ex vivo, snabbt förlorar sin funktion vid isolering, och är en begränsad källa. Ett alternativ till pHH är användningen av inducerade pluripotenta stamceller (iPSC)-härledda hepatocyter (iHeps)10. Noterbart iPSCs är patient-specifika och kan odlas på obestämd tid, så iHeps kan produceras på efterfrågan, som är en betydande fördel över färska pHH. Dessutom iPSCs kan också vara enkelt genetiskt manipulerade med designer nukleaser att korrigera eller införa mutationer i en syngena bakgrund att tillåta mer trogen jämförelser11.
Mänskliga levern chimär mus med rekonstituerades pHH uppvisar likheter till människor i leverns metaboliska profiler, drog svaren och känslighet för hepatit virus infektion12. Detta gör dem en bra modell för att studera hyperlipidemi i vivo. Mest använda musmodeller är baserade på/Fah– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (FRG) mus13 och uPA transgena möss8, varav upp till 95% av musen levern kan ersättas pHH. Intressant, beskrivs en färsk rapport en mänsklig FH lever chimär mus (baserat på FRG musen) med pHH från en patient som bär en homozygot Receptorn mutation14. I denna modell, de nyinsatta humana hepatocyterna hade inga funktionella Receptorn, men kvarstående mus hepatocyter gjorde, vilket minskar verktyget för att utföra i vivo tester av droger att förlita sig på Receptorn vägen.
Vi rapporterar här, ett detaljerat protokoll baserat på våra nyligen publicerade arbete15 för implantation FH iHeps in i/receptorn– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (LRG) mus levern. Denna mänskliga levern chimär mus är användbar för modellering FH och utföra drogtester invivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidigare studier med iHeps hos gnagare har bekräftat att de är ett effektivt sätt att studera ärftliga leversjukdomar17. För att ytterligare öka användningen av denna teknik och eftersom nuvarande FH djurmodeller är suboptimal, vi rekonstituerades FH iHeps i LRG möss och visade att den rekonstituerades Receptorn +/- eller heterozygot Receptorn-muterade FH iHeps kan minska möss plasma LDL-C nivå och svara på lipidsänkande läkemedel i vivo.
<p class="jove…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete var stöds av Shenzhen Science och Technology rådets grundläggande Research Program (JCYJ20150331142757383), strategisk prioritet forskningsprogram av den kinesiska Vetenskapsakademien (XDA16030502), Hong Kong Research Grant rådet tema baserad forskning Systemet (T12-705/11), samarbete Program av forskning stipendier rådets Hongkongs speciella administrativa Region och National Natural Science Foundation i Kina (N-HKU730/12 och 81261160506), Team forskningsprojekt av Guangdong naturliga vetenskapen Foundation (2014A030312001), Guangzhou Science och Technology Program (201607010086), och Guangdongprovinsen Science och Technology Program (2016B030229007 och 2017B050506007).
Materials
| Materials | |||
| 40 µm Cell strainer | BD | B4-VW-352340 | |
| 6-Well plate | Thermofisher | 140675 | Extracellular matrix coated |
| Accutase | Millipore | SCR005 | |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich | A6625 | Dissolve in water |
| Antigen retrieval solution | IHC World | IW-1100-1L | |
| Calcium chloride | Sigma Aldrich | C8106 | CaCl2 |
| Cell dissociation enzyme | Thermofisher | 12604-013 | TrypLE |
| D-glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | D5879 | DMSO |
| DMEM | Thermofisher | 10829 | Knockout DMEM |
| DNase I | Roche | 11284932001 | |
| EDTA | USB | 15694 | 0.5 M, PH=8.0 |
| Extracellular matrix (for cell suspension) | Corning | 354234 | Matrigel |
| Extracellular matrix (for iHep differentiation) | Corning | 354230 | Matrigel |
| Hepatocyte basal medium | Lonza | CC-3199 | |
| Hepatocyte culture medium | Lonza | CC-3198 | |
| High-fat and high-cholesterol diet | Research Diet | D12079B | |
| Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
| Human hepatocyte growth factor | Peprotech | 100-39 | |
| Human iPSC maintenance medium | STEMCELL Technologies | 5850 | mTeSR1 |
| Human oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
| Ketamine 10% | Alfasan | N/A | |
| L-glutamine | Thermofisher | 35050 | |
| LDL-C detection kit | WAKO | 993-00404 and 993-00504 | |
| Magnesium chloride | VWR | P25108 | MgCl2 |
| Meloxicam | Boehringer Ingelheim | NADA 141-213 | |
| Monopotassium phosphate | USB | S20227 | KH2PO4 |
| Non-essential amino acids | Thermofisher | 11140 | |
| PBS | GE | SH30256.02 | Calcium and magnesium-free |
| PCSK9 antibodies | Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals | SAR236553/REGN727 | Alirocumab |
| Phenobarbital | Alfamedic company | 013003 | |
| Phenylephrine | RBI | P-133 | Dissolve in water |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9333 | KCl |
| Povidone-iodine | Mundipharma | Betadine | |
| Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF | |
| ROCK inhibitor Y27632 | Sigma Aldrich | Y0503-5MG | |
| RPMI 1640 | Thermofisher | 21875 | |
| Serum replacement | Thermofisher | 10828 | |
| Silicone coated petri dish | Dow Corning | Sylgard 184 silicone elastomer kit | |
| Simvastatin | Merck Sharp & Dohme | ZOCOR | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6297 | NaHCO3 |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S7653 | NaCl |
| Trypan blue solution 0.4% | Thermofisher | 15250061 | |
| U-46619 | Cayman | 16450 | Dissolve in DMSO |
| Xylazine 2% | Alfasan | N/A | |
| β-mercaptoethanol | Thermofisher | 31350 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| AAT | DAKO | A0012 | 1:400 |
| ALB | Bethyl Laboratories | A80-129 | 1:200 |
| ASGPR | Santa Cruz | Sc-28977 | 1:100 |
| HNF4A | Santa Cruz | Sc-6557 | 1:35 |
| NANOG | Stemgent | 09-0020 | 1:200 |
| OCT4 | Stemgent | 09-0023 | 1:200 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Il2rg-/- | Jacson lab | 003174 | |
| Ldlr-/- | Jacson lab | 002077 | |
| Rag2-/- | Jacson lab | 008449 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipments | |||
| Automated cell counter | Invitrogen | Countess | |
| Gamma irradiator | MDS Nordion | Gammacell 3000 Elan II | |
| Insulin syringe | BD | 324911 | |
| Powerlab | ADInstruments | Model 8/30 | |
| Slides scanning system | Leica biosystems | Aperio scanScope system | |
| Sliding Microtome | Leica biosystems | RM2125RT | |
| Stereomicrocope | Nikon | SMZ800 | |
| Tissue processing system | Leica biosystems | ASP200S | |
| Wire myograph | DMT | 610M | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Softwares | |||
| Digital slide viewing software | Leica | Aperio ImageScope Version 12.3.2 | |
| Image J | NIH | Version 1.51e | |
| Image processing software | Adobe | Photoshop CC Version 2015 | |
| Microscope imaging software | Carl Zeiss | AxioVision LE Version 4.7 |
Referências
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
- Endo, A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors. J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).
- Dubuc, G., et al. Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia. Arterioscler Thrombo Vasc Biol. 24 (8), 1454-1459 (2004).
- Robinson, J. G., et al. Efficacy and safety of alirocumab in reducing lipids and cardiovascular events. N Engl J Med. 372 (16), 1489-1499 (2015).
- Fitzgerald, K., et al. Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial. Lancet. 383 (9911), 60-68 (2014).
- Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. J Clin Invest. 92 (2), 883-893 (1993).
- Watanabe, Y. Serial inbreeding of rabbits with hereditary hyperlipidemia (WHHL-rabbit). Atherosclerosis. 36 (2), 261-268 (1980).
- Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. J Clin Invest. 124 (11), 4953-4964 (2014).
- Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol. 165 (3), 901-912 (2004).
- Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
- Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
- Bissig, K. D., et al. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment. J Clin Invest. 120 (3), 924-930 (2010).
- Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice. Nat Biotechnol. 25 (8), 903-910 (2007).
- Bissig-Choisat, B., et al. Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model. Nat Commun. 6, 7339 (2015).
- Yang, J., et al. Generation of human liver chimeric mice with hepatocytes from familial hypercholesterolemia induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 8 (3), 605-618 (2017).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Chen, Y., et al. Amelioration of hyperbilirubinemia in gunn rats after transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Stem Cell Rep. 5 (1), 22-30 (2015).
- Ortmann, D., Vallier, L. Variability of human pluripotent stem cell lines. Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).
- Liu, H., Kim, Y., Sharkis, S., Marchionni, L., Jang, Y. Y. In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins. Sci Transl Med. 3 (82), 82ra39 (2011).
