心臓の遺伝子がマウスでの編集の CRISPR アデノ随伴ウイルスを介した配信
Summary
ここで生体内で心臓遺伝子組換えアデノ ウイルス (下さい rAAV) を用いたマウスで編集を実行する詳細なプロトコルを提供-CRISPR の配信を介する。このプロトコルは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの筋ジストロフィーの心筋症を治療するために有望な治療戦略を提供しています、生後マウス心臓固有ノックアウトを生成する使用ことができます。
Abstract
クラスター化、定期的に空間、短い、回文の繰り返し (CRISPR) システムは、培養細胞のさまざまな種から生きている有機体のゲノム工学を促進しています。CRISPR 技術は、人間の病気の治療薬として検討されています。概念実証データは可能性とマウスモデルを用いたデュシェンヌ型筋ジストロフィー (DMD) の遺伝子編集ベース アプローチの有効性を示す最近の研究に代表される非常に心強いものです。黄色ブドウ球菌CRISPR 関連タンパク質 9 の効率的な心筋配信 (SaCas9) と 2 つの特に、組換えアデノ随伴ウイルス (下さい rAAV) 血清型 rh.74 (rAAVrh.74) の静脈内投与と腹腔内注入が有効になって23 マウスDmd遺伝子のエクソンに変異のコドン ゲノム領域を削除する Rna (gRNA) をご案内します。興味の遺伝子をノックアウトして生後マウスの心機能を研究、gRNA の遺伝子のコーディングの地域をターゲットに設計されている場合、これと同じアプローチを使用もできます。このプロトコルでは rAAVrh.74 CRISPR ベクトルをエンジニア リングする方法と新生児マウスで高効率な心臓配送を達成するために詳細に示します。
Introduction
クラスター化、定期的に空間、短い回文リピート (CRISPR) 技術はゲノム工学の最も最近の進歩を表し、細胞および生物における遺伝学の現在の習慣をもたらしました。CRISPR 関連のエンドヌクレアーゼ CRISPR 関連タンパク質 9 (Cas9) などを直接単一ガイド RNA (gRNA) を利用してゲノムの CRISPR ベース編集とは、protospacer に補足シーケンスのゲノム DNA ターゲットに Cpf1 と gRNA でエンコードされた、特定の protospacer の隣接するモチーフ (PAM) の1,2。PAM は、Cas9 または Cpf1 の遺伝子の細菌種によって異なります。化膿連鎖球菌(SpCas9) から派生した一般的に使用される Cas9 ヌクレアーゼは、非ターゲット鎖に DNA に直接下流ターゲット シーケンスのある NGG の PAM のシーケンスを認識します。ターゲット ・ サイトで Cas9 と Cpf1 蛋白質を生成する非相同末端結合 (NHEJ) と相同性向け修理 (HDR) 経路3を含む組み込みの細胞 DNA 修復機構によって修復され、二重鎖切断 (DSB) 4。相同組換えの DNA のテンプレートがない場合は、DSB は主に修復に挿入や削除 (オクターリピート) 生じるエラーを起こしやすい NHEJ 経路による DSB がコーディングで作成された場合、フレーム シフト突然変異を引き起こしているヌクレオチドの遺伝子5,6の領域。したがって、遺伝子の機能を調べるために、CRISPR システムを様々 な細胞モデルと全有機体の機能喪失変異をエンジニアに広く使用がされています。また、触媒非アクティブの Cas9 と Cpf1 発現に開発されている、epigenetically ターゲット遺伝子7,8の発現を調節します。
最近では、SpCas9 と SaCas9 (黄色ブドウ球菌由来) パッケージ化されている遺伝子組換えアデノ随伴ウイルス (下さい rAAV) ベクトルの人間の病気の動物モデルの生後遺伝子補正のために特に、デュシェンヌ型筋ジストロフィー筋ジストロフィー (DMD)9,10、11,12,13,14,15。DMD はジストロフィン蛋白質16,17をエンコード、 DMDの遺伝子で突然変異によって引き起こされる致命的な X 連鎖劣性病気新生児マスス クリーニング18によると約 1 つで 3500 男性出産に影響を与える,19. 進歩的な筋肉弱さと無駄が特徴です。DMD 患者は通常 20-30 年20歳で 10 歳以上 12 歳未満と呼吸や心臓の障害で死ぬと歩行能力を失います。心筋症を開発する特に、> 90% の DMD 患者と DMD 患者21,22の死の主要な原因を表します。Deflazacort (抗炎症薬) と Eteplirsen (エクソン 51 をスキップのための薬をスキップ エクソン) 最近によって承認されている DMD の食品医薬品局 (FDA)23,24、これらの治療のどれもがゲノム DNA レベルで遺伝的欠陥を修正します。エクソン 23 ジストロフィン遺伝子の点突然変異を運ぶ、mdx マウスは、DMD モデル25として広く使用されています。さらに、我々 は以前、機能的なジストロフィン式カバー エクソン 21、22、23 筋肉内の広告-SpCas9/gRNA 配信9 を使用してmdxマウス骨格筋でゲノム DNA のフレームの削除によって復元された実証、および静脈内、腹腔内の rAAVrh.74-SaCas9/gRNA 配信26を使用してmdx/研究+/-マウスの心臓の筋肉。
このプロトコルで生後心臓遺伝子の心臓の筋肉のセクションでジストロフィン解析 gRNA 設計からの rAAVrh.74-SaCas9/gRNA ベクトルを使用してmdx/研究+/-マウスでジストロフィンを復元する編集のあらゆるステップ詳細に述べる。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、生体内で心臓遺伝子 SaCas9 と 2 つの gRNAs の rAAVrh.74 を介した配信を使用して産後のマウスで編集を達成するために必要なすべての手順を詳しく説明します。前述のとおり、このアプローチは、私たちの仕事の27日に記載されている筋ジストロフィー マウスにおけるジストロフィン式を復元する使用ことができますがそれはの長いプロセスを使用?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
相対湿度は、米国国立衛生研究所健康補助金 (R01HL116546 および R01 AR064241) によってサポートされます。
Materials
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Series A2 Class II, Type A2 |
| BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
| Competent cells | Agilent Technologies | 200314 | |
| Cell culture dishes, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
| Dystrophin antibody | Spring Bioscience | E2660 | |
| Fast-Ion Midi Plasmdi Kits | IBI Scientific | IB47111 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
| Filter Unit, 0.45μm | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7122 | |
| High-speed plasmid mini kit | IBI Scientific | IB47102 | |
| Horse serum | Abcam | ab139501 | |
| Isotemp 2239 Water Bath | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
| Isotemp Heat Block | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | LSM 780 | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Instrument II |
| Large Capacity Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
| Nanodrop spectrophotometers | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ 2000/2000c |
| Oligos for i20-F | Integrated DNA Technologies | CACCgGGCGTTGAAATTCTCATTAC | |
| Oligos for i20-R | Integrated DNA Technologies | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | |
| Oligos for i23-F | Integrated DNA Technologies | CACCgCACCGATGAGAGGGAAAGGTC | |
| Oligos for i23-R | Integrated DNA Technologies | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
| Oligos | Integrated DNA Technologies | ||
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| Quick-Seal centrifuge tube | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits | Alkali Scientific | QS2005 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
| Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Type 70Ti |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs Inc | M0202S | |
| Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
| Ultra centrifugal filter unit | MilliporeSigma | UFC510096 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories, Inc | H-1200 |
Referências
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