Entrega de mediada por vírus adeno-associado de CRISPR para Gene cardíaco em ratos de edição
Summary
Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para realizar na vivo edição de gene cardíaca em ratos usando recombinantes Adeno-Associated vírus (rAAV)-mediada entrega de CRISPR. Este protocolo oferece uma promissora estratégia terapêutica para tratar a cardiomiopatia distrófica em distrofia muscular de Duchenne e pode ser usado para gerar o nocaute cardíaco-específicas em ratos pós-natal.
Abstract
O sistema (CRISPR) repetição clusterizado regularmente intercalado, curto, palíndromo tem facilitada engenharia do genoma em culturas de células e organismos vivos de uma grande variedade de espécies. A tecnologia CRISPR também tem sido explorada como romance terapêuticas para um número de doenças humanas. Dados de prova de conceito são altamente animadores, como exemplificado por estudos recentes que demonstram a viabilidade e a eficácia da abordagem terapêutica baseada em edição de gene para a distrofia muscular de Duchenne (DMD) usando um modelo murino. Em particular, a injeção intraperitoneal e intravenosa do sorotipo de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) rh.74 (rAAVrh.74) permitiu cardíaca uma entrega eficiente de proteínas associadas CRISPR 9 o Staphylococcus aureus (SaCas9) e dois Guia de RNAs (gRNA) para excluir uma região genômica com um códon mutante no exon 23 do gene Dmd de rato. Esta mesma abordagem também pode ser usada para nocautear o gene de interesse e estudar sua função cardíaca em camundongos pós-natal quando a gRNA destina-se a região codificante do gene-alvo. Neste protocolo, mostramos em detalhes como engenheiro vector rAAVrh.74-CRISPR e como conseguir altamente eficiente entrega cardíaca em camundongos neonatais.
Introduction
A cluster, regularmente intercalada, curta palíndromo repetição (CRISPR) tecnologia representa o mais recente avanço na engenharia de genoma e revolucionou a prática atual da genética em células e organismos. Edição baseada em CRISPR genoma utiliza um guia único RNA (gRNA) para direcionar uma endonuclease CRISPR associadas tais como proteínas associadas CRISPR 9 (Cas9) e Cpf1 para um alvo de DNA genômico complementar em sequência para o protospacer codificada pela gRNA com um protospacer específico motivo adjacentes (PAM)1,2. O PAM varia dependendo da espécie bacteriana do gene Cas9 ou Cpf1. O mais comumente usado nuclease Cas9 derivado de Streptococcus pyogenes (SpCas9) reconhece uma sequência de PAM de NGG que encontra-se diretamente a jusante da sequência alvo no DNA genômico, na vertente não-alvo. No local de destino, as proteínas Cas9 e Cpf1 geram uma ruptura da dobro-Costa (DSB), que então é reparada via intrínsecos mecanismos reparação DNA celulares, incluindo não-homóloga final juntando (NHEJ) e reparação de homologia-dirigido (HDR) vias3, 4. Na ausência de um modelo de DNA para recombinação homóloga, ORL é reparado principalmente por via NHEJ propenso a erro, que pode resultar em inserções ou exclusões (puntuais) de nucleotídeos, causando mutações frameshift se o ORL foram criado na codificação região de um gene5,6. Assim, o sistema CRISPR amplamente serviu para engenheiro-perda da função de mutações em vários modelos de celulares e organismos de todo, a fim de investigar a função de um gene. Além disso, o Cas9 cataliticamente inactiva e Cpf1 têm sido desenvolvidos para transcricionalmente e epigenetically modulam a expressão de genes de alvo7,8.
Mais recentemente, tanto SpCas9 e SaCas9 (derivado de Staphylococcus aureus) foram embalados em vetores de vírus adeno-associado recombinante (rAAV) para correção do gene pós-natal no modelo animal de doenças humanas, particularmente, Duchenne distrofia muscular (de Duchenne DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD é uma doença fatal e ligada ao X recessiva causada por mutações no gene DMD , que codifica a distrofina proteína16,17, afetando aproximadamente 1 em 3500 nascimentos masculinos de acordo com o teste do pezinho18 , 19. é caracterizada por fraqueza muscular progressiva e a perder. Os pacientes DMD geralmente perdem a habilidade de andar entre 10 e 12 anos de idade e morrem de insuficiência respiratória e/ou cardíaca com a idade de 20-30 anos20. Notavelmente, cardiomiopatia desenvolve em > 90% dos pacientes DMD e representa a principal causa de morte em pacientes DMD21,22. Embora o Deflazacort (um medicamento anti-inflamatório) e Eteplirsen (um exon saltando de medicina para saltar o exon 51) recentemente foram aprovados para DMD pelo Food and Drug Administration (FDA)23,24, nenhum destes tratamentos corrigi o defeito genético no nível do DNA genômico. O mdx mouse, que transporta uma mutação pontual no exon 23 do gene da distrofina, tem sido amplamente utilizado como um DMD modelo25. Além disso, temos demonstrado anteriormente que a expressão de distrofina funcional foi restaurada por exclusão em-frame do DNA genômico cobrindo exões, 21, 22 e 23 em músculos esqueléticos de camundongos mdx usando intramuscular entrega de Ad-SpCas9/gRNA9 e dos músculos do coração de camundongos mdx/Utrofina+ /- usando intraperitoneal e intravenosa entrega de rAAVrh.74-SaCas9/gRNA26.
Neste protocolo, descrevemos em detalhe cada etapa no gene cardíaca pós-natal de edição para restaurar a distrofina em camundongos mdx/Utrofina+ /- usando vetores de rAAVrh.74-SaCas9/gRNA, desde a concepção de gRNA para análise de distrofina nas seções de músculo do coração.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, detalhamos todas as etapas necessárias para alcançar na vivo cardíaca gene edição no pós-natal ratos usando entrega mediada por rAAVrh.74 de SaCas9 e dois gRNAs. Como já observado, esta abordagem pode ser usada para restaurar a expressão da distrofina em camundongos distróficos, conforme descrito em nosso trabalho27, mas isso também poderia permitir estudos de genética reversa rápida de genes relacionados ao cardíaco em camundongos sem o longo processo do abo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
R.H. é suportado pelo U.S. National Institutes of subsídios saúde (R01HL116546 e AR064241 R01).
Materials
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Series A2 Class II, Type A2 |
| BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
| Competent cells | Agilent Technologies | 200314 | |
| Cell culture dishes, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
| Dystrophin antibody | Spring Bioscience | E2660 | |
| Fast-Ion Midi Plasmdi Kits | IBI Scientific | IB47111 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
| Filter Unit, 0.45μm | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7122 | |
| High-speed plasmid mini kit | IBI Scientific | IB47102 | |
| Horse serum | Abcam | ab139501 | |
| Isotemp 2239 Water Bath | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
| Isotemp Heat Block | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | LSM 780 | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Instrument II |
| Large Capacity Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
| Nanodrop spectrophotometers | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ 2000/2000c |
| Oligos for i20-F | Integrated DNA Technologies | CACCgGGCGTTGAAATTCTCATTAC | |
| Oligos for i20-R | Integrated DNA Technologies | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | |
| Oligos for i23-F | Integrated DNA Technologies | CACCgCACCGATGAGAGGGAAAGGTC | |
| Oligos for i23-R | Integrated DNA Technologies | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
| Oligos | Integrated DNA Technologies | ||
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| Quick-Seal centrifuge tube | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits | Alkali Scientific | QS2005 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
| Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Type 70Ti |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs Inc | M0202S | |
| Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
| Ultra centrifugal filter unit | MilliporeSigma | UFC510096 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories, Inc | H-1200 |
Referências
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