Entrega de mediada por Virus adeno-asociado de CRISPR para Gene cardiaco en ratones
Summary
Aquí proporcionamos un protocolo detallado para llevar a cabo en vivo gene cardiaco edición en ratones usando Virus de Adeno-Associated recombinante (rAAV)-mediado entrega de CRISPR. Este protocolo ofrece una estrategia terapéutica prometedora para tratar cardiomiopatía distrófica en distrofia muscular de Duchenne y puede utilizarse para generar nocaut cardiaco específico en los ratones postnatales.
Abstract
Agrupado, regularmente otro, corto, palindrómico repetición (CRISPR) sistema ha facilitado enormemente ingeniería del genoma en células cultivadas y los organismos vivos de una gran variedad de especies. La tecnología CRISPR también se ha explorado como novela terapéutica para un número de enfermedades humanas. Datos de prueba de concepto son altamente alentadores ejemplificado por estudios recientes que demuestran la viabilidad y la eficacia del enfoque terapéutico basado en la edición de gene para la distrofia muscular de Duchenne (DMD) utilizando un modelo murino. En particular, intravenosa e intraperitoneal inyección de la rh.74 del serotipo del virus adeno-asociado recombinante (rAAV) (rAAVrh.74) ha permitido la entrega eficiente cardiaca de Staphylococcus aureus proteína CRISPR 9 (SaCas9) y dos Guía RNAs (gRNA) para eliminar una región genómica con un codón mutante en el exón 23 del gen Dmd de ratón. Este mismo método puede utilizarse también para noquear el gen de interés y estudiar su función cardiaca en ratones postnatales cuando el gRNA está diseñado para atacar la región codificante del gen. En este protocolo, se muestra en detalle cómo Ingeniero vector rAAVrh.74 CRISPR y cómo lograr el parto alta eficiencia cardiaca en ratones neonatales.
Introduction
El cluster regularmente otro corto palindrómico repetición (CRISPR) tecnología, representa el avance más reciente en la ingeniería del genoma y ha revolucionado la práctica actual de la genética en las células y organismos. La edición del genoma basado en CRISPR utiliza una guía única RNA (gRNA) para dirigir una endonucleasa asociada a CRISPR como proteína CRISPR 9 (Cas9) y Cpf1 con un objetivo de ADN genómico que es complementario en orden a la protospacer codificada por el gRNA con un protospacer específico motivo adyacente (PAM)1,2. El PAM varía dependiendo de la especie bacteriana del gen Cas9 o Cpf1. El más comúnmente utilizado nucleasa Cas9 derivado de Streptococcus pyogenes (SpCas9) reconoce una secuencia de PAM de NGG que en el ADN genómico, en la cadena de destino no se encuentra directamente aguas abajo de la secuencia de destino. En el sitio de destino, las proteínas Cas9 y Cpf1 generan una rotura de doble cadena (DSB), que entonces se repara vía intrínseca celular ADN mecanismos de reparación incluyendo final no homólogo a (NHEJ) y vías de reparación dirigido por homología (HDR)3, 4. En ausencia de una plantilla de ADN por recombinación homóloga, el OSD se repara sobre todo por la vía NHEJ propenso, que puede resultar en inserciones o deleciones (indels) de nucleótidos causando mutaciones del mutágeno ‘ frameshift ‘ si el OSD se crearon en la codificación región de un gen5,6. Así, el sistema CRISPR ha sido ampliamente utilizado para las mutaciones de pérdida de función en varios modelos de celulares y organismos enteros, con el fin de investigar la función de un gen. Por otra parte, el catalítico inactivo Cas9 Cpf1 transcripcionalmente se han desarrollado para y epigenéticamente modulan la expresión de genes de destino7,8.
Más recientemente, SpCas9 y SaCas9 (derivado de estafilococo áureo) han sido empaquetados en vectores de virus adeno-asociado recombinante (rAAV) para la corrección del gen postnatal en modelos animales de enfermedades humanas, en particular, Duchenne distrofia muscular (DMD)9,10,11,12,13,14,la15. DMD es una enfermedad recesiva x-ligada fatal causada por mutaciones en el gen DMD , que codifica la distrofina proteína16,17, que afecta a aproximadamente uno en 3500 nacimientos masculinos según evaluación del recién nacido18 , 19. se caracteriza por debilidad muscular progresiva y pérdida. Los pacientes DMD suelen perder la habilidad de caminar entre 10 y 12 años de edad y mueren de insuficiencia respiratoria o cardiaca a la edad de 20-30 años20. En particular, la miocardiopatía se convierte en > 90% de los pacientes DMD y representa la causa principal de muerte en pacientes DMD21,22. Aunque Deflazacort (una droga antiinflamatoria) y Eteplirsen (un exón que salta medicina para salto de exón 51) se han aprobado recientemente para DMD por alimentos y drogas (FDA)23,24, ninguno de estos tratamientos corregir el defecto genético en el nivel genomic de la DNA. El ratón mdx, que lleva una mutación de punto en el exón 23 del gene del dystrophin, ha sido ampliamente utilizado como un modelo DMD25. Además, previamente demostramos que la expresión de distrofina funcional fue restablecida por la eliminación en el marco de la DNA genomic que abarca exones 21, 22 y 23 en los músculos esqueléticos de ratones mdx con entrega de Ad-SpCas9/gRNA intramuscular9 y en los músculos del corazón de mdx/utrophin+- ratones con entrega rAAVrh.74-SaCas9/gRNA intravenosa e intraperitoneales26.
En este protocolo, describimos en detalle cada paso en la edición de postnatal gen cardiaca para restaurar distrofina en mdx/utrophin+- ratones utilizando vectores de rAAVrh.74-SaCas9/gRNA, de gRNA diseño análisis de distrofina en las secciones de músculo de corazón.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, detallamos todos los pasos necesarios para lograr en vivo gene cardiaco edición en ratones postnatales con entrega mediada por el rAAVrh.74 de SaCas9 y dos gRNAs. Como se señaló anteriormente, este enfoque puede utilizarse para restaurar la expresión de distrofina en ratones distróficos como se describe en nuestro trabajo27, pero también podría permitir estudios de genética reversa rápida de genes relacionados con cardiaco en ratones sin el largo proceso de la …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
H.R. es apoyado por los E.E.U.U. institutos nacionales de salud subvenciones (R01HL116546 R01 AR064241).
Materials
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Series A2 Class II, Type A2 |
| BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
| Competent cells | Agilent Technologies | 200314 | |
| Cell culture dishes, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
| Dystrophin antibody | Spring Bioscience | E2660 | |
| Fast-Ion Midi Plasmdi Kits | IBI Scientific | IB47111 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
| Filter Unit, 0.45μm | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7122 | |
| High-speed plasmid mini kit | IBI Scientific | IB47102 | |
| Horse serum | Abcam | ab139501 | |
| Isotemp 2239 Water Bath | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
| Isotemp Heat Block | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | LSM 780 | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Instrument II |
| Large Capacity Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
| Nanodrop spectrophotometers | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ 2000/2000c |
| Oligos for i20-F | Integrated DNA Technologies | CACCgGGCGTTGAAATTCTCATTAC | |
| Oligos for i20-R | Integrated DNA Technologies | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | |
| Oligos for i23-F | Integrated DNA Technologies | CACCgCACCGATGAGAGGGAAAGGTC | |
| Oligos for i23-R | Integrated DNA Technologies | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
| Oligos | Integrated DNA Technologies | ||
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| Quick-Seal centrifuge tube | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits | Alkali Scientific | QS2005 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
| Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Type 70Ti |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs Inc | M0202S | |
| Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
| Ultra centrifugal filter unit | MilliporeSigma | UFC510096 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories, Inc | H-1200 |
Referências
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