Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll att utföra i vivo redigering hjärt genen i möss med rekombinant Adeno-Associated Virus (rAAV)-medierad leverans av CRISPR. Detta protokoll erbjuder en lovande terapeutisk strategi för att behandla dystrofa kardiomyopati Duchennes muskeldystrofi och kan användas för att generera hjärt-specifika knockout i postnatal möss.
Klustrade regelbundet mellanliggande, kort, palindromic upprepa (CRISPR) systemet har underlättat genomet engineering i både odlade celler och levande organismer från en mängd olika arter. Den CRISPR-teknologin har också undersökts som romanen therapeutics för ett antal sjukdomar. Proof-of-concept data är mycket uppmuntrande som exemplifieras av senaste studier som visar för genomförbarhet och effekten av genen redigering-baserade behandlingsmetoder för Duchennes muskeldystrofi (DMD) använder en murin modell. I synnerhet har intravenös och intraperitoneal injektion av den rekombinanta adeno-associerade virus (rAAV) serotyp rh.74 (rAAVrh.74) möjliggjort effektiv hjärt leverans av Staphylococcus aureus CRISPR-associerade protein 9 (SaCas9) och två Guide RNAs (gärna) om du vill radera en genomisk region med en mutant kodon i exon 23 av mus Dmd -genen. Denna samma strategi kan också användas för att slå ut den gen-of-intressen och studera deras hjärtfunktion hos postnatal möss när gärna är utformade för att rikta den kodande regionen av genen. I detta protokoll visar vi i detalj hur man ingenjör rAAVrh.74-CRISPR vektor och hur man kan uppnå mycket effektiv hjärt leverans hos neonatala möss.
Klustrade, regelbundet mellanliggande, kort palindromic upprepa (CRISPR) tekniken representerar den senaste utvecklingen i genomet engineering och har revolutionerat nuvarande praxis i genetik i celler och organismer. CRISPR-baserade gen editering använder en enda guide RNA (gärna) för direkt en CRISPR-associerade Amiiiiin såsom CRISPR-associerade protein 9 (Cas9) och Cpf1 till måltavla för genomisk DNA som är ett komplement i sekvens till protospacer kodas av gärna med en specifika protospacer angränsande motiv (PAM)1,2. PAM varierar beroende på bakteriearter av Cas9 eller Cpf1 genen. Den vanligaste Cas9 nuclease härrör från Streptococcus pyogenes (SpCas9) erkänner en PAM sekvens av NGG som finns direkt efter målet sekvensen i genomisk DNA, på det målarter strand. På målplatsen generera Cas9 och Cpf1 proteinerna en dubbel-strand paus (DSB), som sedan repareras via inneboende cellulär DNA reparationsmekanismer, inklusive icke-homolog slutet att gå (NHEJ) och homologi-regisserad reparation (HDR) vägar3, 4. I avsaknad av en DNA mall för homolog rekombination repareras DSB primärt av felbenägna NHEJ vägen, vilket kan resultera i infogningar och borttagningar (indels) av nukleotider som orsakar frameshift mutationer om DSB skapades i kodning regionen en gen5,6. Således, CRISPR systemet har använts till ingenjör förlust-av-funktion mutationer i olika cellulära modeller och hela organismer, för att undersöka funktionen av en gen. Dessutom de katalytiskt inaktiva Cas9 och Cpf1 har utvecklats för att transcriptionally och modulera epigenetiskt uttrycket av mål gener7,8.
Mer nyligen, både SpCas9 och SaCas9 (härlett från Staphylococcus aureus) har förpackats i rekombinant adeno-associerade (rAAV) virusvektorer vid postnatal gen korrigering i en djurmodell av mänskliga sjukdomar, särskilt, Duchennes muskeldystrofi (DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD är en dödlig X-bunden recessiv sjukdom orsakas av mutationer i genen DMD , som kodar dystrofin protein16,17, som drabbar ungefär en i 3500 manliga födda enligt nyfödda screening18 , 19. den kännetecknas av progressiv muskelsvaghet och slöseri. DMD patienter förlora brukar förmågan att gå mellan 10 och 12 år och dör av respiratoriska och kardiella misslyckande av 20-30 år20år. Särskilt, kardiomyopati framkallar i > 90% av DMD patienter och representerar ledande orsaka död i DMD patienter21,22. Även om Deflazacort (en anti-inflammation läkemedel) och Eteplirsen (en exon hoppa medicin för att hoppa exon 51) har nyligen godkänts för DMD av Food and Drug Administration (FDA)23,24, ingen av dessa behandlingar korrigera den genetiska defekten på genomisk DNA-nivå. MDX-musen, som bär en punktmutation på exon 23 i dystrofingenen, har använts som en DMD modell25. Dessutom har vi tidigare visat att uttrycket funktionella dystrofin restaurerades av i-ram radering av genomisk DNA som omfattar exonerna 21, 22 och 23 i skelettmuskulaturen mdx möss med intramuskulär Ad-SpCas9/gärna leverans9 , och i hjärtat musklerna i mdx/utrophin+ / möss med intravenös och intraperitoneal rAAVrh.74-SaCas9/gärna leverans26.
I detta protokoll beskriver vi i detalj varje steg i postnatal hjärt gen redigering om du vill återställa dystrofin i mdx/utrophin+ / möss med rAAVrh.74-SaCas9/gärna vektorer, gärna design till dystrofin analys i avsnitten hjärtat muskler.
I detta protokoll detalj vi alla stegen för att uppnå i vivo hjärt gen redigering i postnatal möss med rAAVrh.74-medierad leverans av SaCas9 och två gRNAs. Som tidigare nämnts, detta tillvägagångssätt kan användas för att återställa dystrofin uttryck i dystrofa möss som beskrivs i vårt arbete27, men det kan även aktivera snabb omvänd genetik studier av hjärt-relaterade gener hos möss utan den utdragna processen för den traditionella knockout metod att generera och ras …
The authors have nothing to disclose.
R.H. stöds av amerikanska National Institutes of Health bidrag (R01HL116546 och R01 AR064241).
Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Series A2 Class II, Type A2 |
BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
Competent cells | Agilent Technologies | 200314 | |
Cell culture dishes, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
Dystrophin antibody | Spring Bioscience | E2660 | |
Fast-Ion Midi Plasmdi Kits | IBI Scientific | IB47111 | |
FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
Filter Unit, 0.45μm | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
GoTaq Master Mixes | Promega | M7122 | |
High-speed plasmid mini kit | IBI Scientific | IB47102 | |
Horse serum | Abcam | ab139501 | |
Isotemp 2239 Water Bath | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
Isotemp Heat Block | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | LSM 780 | |
LightCycler 480 instrument | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Instrument II |
Large Capacity Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
Nanodrop spectrophotometers | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ 2000/2000c |
Oligos for i20-F | Integrated DNA Technologies | CACCgGGCGTTGAAATTCTCATTAC | |
Oligos for i20-R | Integrated DNA Technologies | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | |
Oligos for i23-F | Integrated DNA Technologies | CACCgCACCGATGAGAGGGAAAGGTC | |
Oligos for i23-R | Integrated DNA Technologies | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
Oligos | Integrated DNA Technologies | ||
OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
Polyethylenimine | Polysciences | 23966 | |
Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
Quick-Seal centrifuge tube | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits | Alkali Scientific | QS2005 | |
RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Type 70Ti |
T4 DNA ligase | New England BioLabs Inc | M0202S | |
Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
Ultra centrifugal filter unit | MilliporeSigma | UFC510096 | |
VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories, Inc | H-1200 |