JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Adeno-associerade Virus-medierad leverans av CRISPR för hjärt gen redigering i möss

Published: August 02, 2018
doi:
10.3791/57560
, , ,
1Department of Surgery, Davis Heart and Lung Research Institute, Biomedical Sciences Graduate Program, Biophysics Graduate Program,Ohio State University Wexner Medical Center

Summary

Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll att utföra i vivo redigering hjärt genen i möss med rekombinant Adeno-Associated Virus (rAAV)-medierad leverans av CRISPR. Detta protokoll erbjuder en lovande terapeutisk strategi för att behandla dystrofa kardiomyopati Duchennes muskeldystrofi och kan användas för att generera hjärt-specifika knockout i postnatal möss.

Abstract

Klustrade regelbundet mellanliggande, kort, palindromic upprepa (CRISPR) systemet har underlättat genomet engineering i både odlade celler och levande organismer från en mängd olika arter. Den CRISPR-teknologin har också undersökts som romanen therapeutics för ett antal sjukdomar. Proof-of-concept data är mycket uppmuntrande som exemplifieras av senaste studier som visar för genomförbarhet och effekten av genen redigering-baserade behandlingsmetoder för Duchennes muskeldystrofi (DMD) använder en murin modell. I synnerhet har intravenös och intraperitoneal injektion av den rekombinanta adeno-associerade virus (rAAV) serotyp rh.74 (rAAVrh.74) möjliggjort effektiv hjärt leverans av Staphylococcus aureus CRISPR-associerade protein 9 (SaCas9) och två Guide RNAs (gärna) om du vill radera en genomisk region med en mutant kodon i exon 23 av mus Dmd -genen. Denna samma strategi kan också användas för att slå ut den gen-of-intressen och studera deras hjärtfunktion hos postnatal möss när gärna är utformade för att rikta den kodande regionen av genen. I detta protokoll visar vi i detalj hur man ingenjör rAAVrh.74-CRISPR vektor och hur man kan uppnå mycket effektiv hjärt leverans hos neonatala möss.

Introduction

Klustrade, regelbundet mellanliggande, kort palindromic upprepa (CRISPR) tekniken representerar den senaste utvecklingen i genomet engineering och har revolutionerat nuvarande praxis i genetik i celler och organismer. CRISPR-baserade gen editering använder en enda guide RNA (gärna) för direkt en CRISPR-associerade Amiiiiin såsom CRISPR-associerade protein 9 (Cas9) och Cpf1 till måltavla för genomisk DNA som är ett komplement i sekvens till protospacer kodas av gärna med en specifika protospacer angränsande motiv (PAM)1,2. PAM varierar beroende på bakteriearter av Cas9 eller Cpf1 genen. Den vanligaste Cas9 nuclease härrör från Streptococcus pyogenes (SpCas9) erkänner en PAM sekvens av NGG som finns direkt efter målet sekvensen i genomisk DNA, på det målarter strand. På målplatsen generera Cas9 och Cpf1 proteinerna en dubbel-strand paus (DSB), som sedan repareras via inneboende cellulär DNA reparationsmekanismer, inklusive icke-homolog slutet att gå (NHEJ) och homologi-regisserad reparation (HDR) vägar3, 4. I avsaknad av en DNA mall för homolog rekombination repareras DSB primärt av felbenägna NHEJ vägen, vilket kan resultera i infogningar och borttagningar (indels) av nukleotider som orsakar frameshift mutationer om DSB skapades i kodning regionen en gen5,6. Således, CRISPR systemet har använts till ingenjör förlust-av-funktion mutationer i olika cellulära modeller och hela organismer, för att undersöka funktionen av en gen. Dessutom de katalytiskt inaktiva Cas9 och Cpf1 har utvecklats för att transcriptionally och modulera epigenetiskt uttrycket av mål gener7,8.

Mer nyligen, både SpCas9 och SaCas9 (härlett från Staphylococcus aureus) har förpackats i rekombinant adeno-associerade (rAAV) virusvektorer vid postnatal gen korrigering i en djurmodell av mänskliga sjukdomar, särskilt, Duchennes muskeldystrofi (DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD är en dödlig X-bunden recessiv sjukdom orsakas av mutationer i genen DMD , som kodar dystrofin protein16,17, som drabbar ungefär en i 3500 manliga födda enligt nyfödda screening18 , 19. den kännetecknas av progressiv muskelsvaghet och slöseri. DMD patienter förlora brukar förmågan att gå mellan 10 och 12 år och dör av respiratoriska och kardiella misslyckande av 20-30 år20år. Särskilt, kardiomyopati framkallar i > 90% av DMD patienter och representerar ledande orsaka död i DMD patienter21,22. Även om Deflazacort (en anti-inflammation läkemedel) och Eteplirsen (en exon hoppa medicin för att hoppa exon 51) har nyligen godkänts för DMD av Food and Drug Administration (FDA)23,24, ingen av dessa behandlingar korrigera den genetiska defekten på genomisk DNA-nivå. MDX-musen, som bär en punktmutation på exon 23 i dystrofingenen, har använts som en DMD modell25. Dessutom har vi tidigare visat att uttrycket funktionella dystrofin restaurerades av i-ram radering av genomisk DNA som omfattar exonerna 21, 22 och 23 i skelettmuskulaturen mdx möss med intramuskulär Ad-SpCas9/gärna leverans9 , och i hjärtat musklerna i mdx/utrophin+ / möss med intravenös och intraperitoneal rAAVrh.74-SaCas9/gärna leverans26.

I detta protokoll beskriver vi i detalj varje steg i postnatal hjärt gen redigering om du vill återställa dystrofin i mdx/utrophin+ / möss med rAAVrh.74-SaCas9/gärna vektorer, gärna design till dystrofin analys i avsnitten hjärtat muskler.

Protocol

De djur som används i detta protokoll upprätthölls på The Ohio State University laboratorium djur resurser i enlighet med riktlinjer för användning av djur. Alla djurstudier bemyndigades av institutionella Animal Care, användning och granskningskommittén av Ohio State University. 1. design och kloning av gRNAs i den CRISPR vektor Välj 2 gRNAs inriktning dystrofin intron 20 och intron 23 (i20 och i23) för SaCas9: i20: 5′-GGGCGTTGAAATTCTCATTAC CAGAGT och i23: 5′-CACC…

Representative Results

Effekten av gRNAs att framkalla strykningen av målregionen genomisk DNA bör utvärderas i cellodlingar innan förpackningen till rAAV för in vivo-studier. För detta ändamål, den gRNAs och SaCas9-uttryckande konstruktioner var electroporated i C2C12 celler och genomisk DNA var analyseras med PCR med primers flankerande mål webbplatser (figur 1). En PCR produkt av ~ 500 bp indikerar framgångsrika radering av målet genomisk DNA följd gen redigering med…

Discussion

I detta protokoll detalj vi alla stegen för att uppnå i vivo hjärt gen redigering i postnatal möss med rAAVrh.74-medierad leverans av SaCas9 och två gRNAs. Som tidigare nämnts, detta tillvägagångssätt kan användas för att återställa dystrofin uttryck i dystrofa möss som beskrivs i vårt arbete27, men det kan även aktivera snabb omvänd genetik studier av hjärt-relaterade gener hos möss utan den utdragna processen för den traditionella knockout metod att generera och ras …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

R.H. stöds av amerikanska National Institutes of Health bidrag (R01HL116546 och R01 AR064241).

Materials

Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG Thermo Fisher Scientific A-21428
Benzonase Nuclease Sigma-Aldrich E1014
Bio Safety Cabinets Thermo Fisher Scientific 1347 1300 Series A2 Class II, Type A2
BsaI New England BioLabs Inc RO535S
Competent cells Agilent Technologies 200314
Cell culture dishes, 150mm Nest Scientific USA 715001
Cryostat Leica Biosystems Leica CM3050S
DMEM Thermo Fisher Scientific MT10017CV Corning cellgro
Dystrophin antibody Spring Bioscience E2660
Fast-Ion Midi Plasmdi Kits IBI Scientific IB47111
FBS Thermo Fisher Scientific 26-140-079
Filter Unit, 0.45μm Thermo Fisher Scientific 166-0045
GoTaq Master Mixes Promega M7122
High-speed plasmid mini kit IBI Scientific IB47102
Horse serum Abcam ab139501
Isotemp 2239 Water Bath Thermo Fisher Scientific 15-460-11Q
Isotemp Heat Block Thermo Fisher Scientific 11-718
Inverted confocal microscope Carl Zeiss Microscopy, LLC LSM 780
LightCycler 480 instrument Roche 5015243001 LightCycler 480 Instrument II
Large Capacity Centrifuge Thermo Fisher Scientific 46-910 Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus
Microcentrifuge Thermo Fisher Scientific 75002445 Sorvall Legend Micro 21R
Nanodrop spectrophotometers Thermo Scientific ND2000CLAPTOP NanoDrop™ 2000/2000c
Oligos for i20-F Integrated DNA Technologies CACCgGGCGTTGAAATTCTCATTAC
Oligos for i20-R Integrated DNA Technologies AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc;
Oligos for i23-F Integrated DNA Technologies CACCgCACCGATGAGAGGGAAAGGTC
Oligos for i23-R Integrated DNA Technologies GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc
Oligos Integrated DNA Technologies
OptiPrep Density Gradient Medium Sigma-Aldrich D1556-250ML
OptiMEM Thermo Fisher Scientific 31985070
PEG8000 Sigma-Aldrich 89510-1kg-F
Polyethylenimine Polysciences 23966
Proteinase K Sigma-Aldrich P2308
Quick-Seal centrifuge tube Beckman Coulter Inc 342414
QIAquick Gel Extraction kit Qiagen 28704
Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits Alkali Scientific QS2005
RevertAid RT Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific K1691
Rotor Beckman Coulter Inc 337922 Type 70Ti
T4 DNA ligase New England BioLabs Inc M0202S
Thermal Cycler Bio-rad 1861096
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596026
Ultracentrifuge Beckman Coulter Inc 8043-30-1192 Optima le-80k
Ultra centrifugal filter unit MilliporeSigma UFC510096
VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories, Inc H-1200
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems. Methods Mol Biol. 1311, 47-75 (2015).
  2. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163, 759-771 (2015).
  3. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
  4. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
  5. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual review of biochemistry. 79, 181-211 (2010).
  6. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols. 8, 2281-2308 (2013).
  7. Zhang, X., Wang, J., Cheng, Q., Zheng, X., Zhao, G. Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1. Cell discovery. 3, 17018 (2017).
  8. Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular therapy. Nucleic acids. 4, e264 (2015).
  9. Xu, L., et al. CRISPR-mediated genome editing restores dystrophin expression and function in mdx mice. Mol Ther. 24, 564-569 (2015).
  10. Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351, 400-403 (2016).
  11. Long, C. Z., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345, 1184-1188 (2014).
  12. Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351, 403-407 (2016).
  13. Ousterout, D. G. K., Thakore, A. M., Majoros, P. I., Reddy, T. E. W. H., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 6, 6244 (2015).
  14. Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
  15. Bengtsson, N. E., et al. Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editing ameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 8, 14454 (2017).
  16. Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
  17. Nowak, K. J., Davies, K. E. Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment. EMBO reports. 5, 872-876 (2004).
  18. Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of neurology. 71, 304-313 (2012).
  19. Mendell, J. R., Lloyd-Puryear, M. Report of MDA muscle disease symposium on newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 48, 21-26 (2013).
  20. Spurney, C. F. Cardiomyopathy of Duchenne muscular dystrophy: current understanding and future directions. Muscle Nerve. 44, 8-19 (2011).
  21. Moriuchi, T., Kagawa, N., Mukoyama, M., Hizawa, K. Autopsy analyses of the muscular dystrophies. Tokushima J Exp Med. 40, 83-93 (1993).
  22. McNally, E. M. New approaches in the therapy of cardiomyopathy in muscular dystrophy. Annual review of medicine. 58, 75-88 (2007).
  23. Baker, D. E. Approvals, Submission, and Important Labeling Changes for US Marketed Pharmaceuticals. Hosp Pharm. 52, 306-307 (2013).
  24. Baker, D. E. Eteplirsen. Hosp Pharm. 52, 302-305 (2017).
  25. Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
  26. Xu, L., et al. CRISPR-mediated Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Function in mdx Mice. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 24, 564-569 (2016).
  27. El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circ Res. 121, 923-929 (2017).
  28. Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
  29. Pozsgai, E. R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice. Gene therapy. 23, 57-66 (2016).
  30. Chicoine, L. G., et al. Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery. Mol Ther. 22, 338-347 (2014).
  31. Chicoine, L. G., et al. Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates. Mol Ther. 22, 713-724 (2014).
  32. Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5, 407-415 (2015).
  33. Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).

Tags

Adeno-associated VirusCRISPRCardiac Gene EditingMuscular DystrophyDystrophinDuchenne’s Muscular DystrophyGene EditingGene TherapyGRNA DesignCRISPR VectorLigation
check_url/pt/57560?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Xu, L., Gao, Y., Lau, Y. S., Han, R. Adeno-Associated Virus-Mediated Delivery of CRISPR for Cardiac Gene Editing in Mice. J. Vis. Exp. (138), e57560, doi:10.3791/57560 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image