Adeno-הקשורים משלוח וירוס בתיווך של CRISPR עבור ג'ין לב עריכה בעכברים
Summary
כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לביצוע ויוו ג’ין לב עריכה בעכברים באמצעות וירוס רקומביננטי Adeno-Associated (rAAV)-מתווכת משלוח של CRISPR. פרוטוקול זה יכול לשמש ליצירת נוקאאוט ספציפיות הלב בעכברים כמחנכת, ומציע אסטרטגיה טיפולית מבטיחה לטיפול dystrophic קרדיומיופתיה ב ניוון שרירים דושן.
Abstract
באשכולות, באופן קבוע interspaced, קצר, palindromic חוזר (CRISPR) המערכת הנחתה במידה רבה את הגנום הנדסת תאים בתרבית והן אורגניזמים חיים מתוך מגוון רחב של מינים. הטכנולוגיה CRISPR חקר גם הוא היה כמו הרומן הרפוי מספר מחלות אנושיות. הוכחה הרעיון נתונים מעודדים מאוד בתיכנונו מחקרים המדגימים את היתכנות והיעילות של ג’ין עריכה המבוססת על הגישה הטיפולית עבור ניוון שרירים דושן (DMD) באמצעות מודל מאתר. בפרט, הזרקה תוך ורידי, בקרום הבטן של וירוס adeno-הקשורים רקומביננטי (rAAV) serotype rh.74 (rAAVrh.74) אפשרה יעיל לב מסירה של Staphylococcus aureus חלבונים הקשורים CRISPR 9 (SaCas9) ו-2 מדריך RNAs (gRNA) כדי למחוק את האזור גנומית בעל codon מוטציה ב אקסון 23 לייעו Dmd העכבר. גישה זו זהה יכול לשמש גם לדפוק את ג’ין-של-הריבית וללמוד את תפקוד הלב שלהם בעכברים כמחנכת כאשר gRNA נועד למטרה האזור קידוד של הגן. ב פרוטוקול זה, אנו מראים בפירוט איך להנדס וקטור rAAVrh.74-CRISPR, איך להשיג יעילים ביותר משלוח הלב בעכברים neonatal.
Introduction
באשכולות, באופן קבוע interspaced, קצר palindromic חוזר (CRISPR) מייצג את ההתקדמות האחרונה בהנדסת הגנום והטכנולוגיה יש מהפכה ונוהגין לגנטיקה תאים, אורגניזמים. עריכת מבוססי CRISPR הגנום מנצל מדריך בודד RNA (gRNA) לכוון endonuclease CRISPR-הקשורים כגון חלבונים הקשורים CRISPR 9 (Cas9), Cpf1 ליעד דנ א גנומי משלים ברצף protospacer מקודד על ידי gRNA עם protospacer ספציפיים מוטיב סמוכים (פאם)1,2. פאם משתנה בהתאם למין חיידקי של הגן Cas9 או Cpf1. נוקלאז Cas9 הנפוץ ביותר נגזר הפישחה ינפל תומימת סטרפטוקוקוס (SpCas9) מזהה רצף פאם הגולה שנמצא ישירות במורד הזרם של הרצף היעד ב- DNA גנומי, על סטרנד-יעד. באתר היעד, החלבונים Cas9 ו- Cpf1 לייצר הפסקה כפולה-סטרנד (DSB), אשר לאחר מכן תיקון דרך מהותי DNA תיקון המנגנונים התאיים כולל קצה שאינם הומולוגיים להצטרף (NHEJ) ותיקון מכוון הומולוגיה (HDR) מסלולים3, 4. בהיעדרו של תבנית ה-DNA עבור רקומבינציה הומולוגית, DSB בעיקר יתוקן על ידי השביל NHEJ לשגיאות, אשר עלולה לגרום שהתוספות או המחיקות (indels) של נוקלאוטידים גרימת מוטציות frameshift אם נוצרו DSB הקידוד אזור של ג’ין5,6. לפיכך, מערכת CRISPR כבר בשימוש נרחב להנדס אובדן-של-פונקציה מוטציות מגוון דגמי הסלולר של אורגניזם שלם, על מנת לחקור את הפונקציה של הגן. יתר על כן, Cas9 ואת Cpf1 catalytically לא פעיל פותחו כדי transcriptionally, epigenetically לווסת את הביטוי של היעד הגנים7,8.
לאחרונה, הן SpCas9 והן SaCas9 (נגזר Staphylococcus aureus) יש היה ארוז לתוך וירוס adeno-הקשורים רקומביננטי (rAAV) וקטורים לתיקון ג’ין כמחנכת במודל החייתי של מחלות האדם, במיוחד, דושן ניוון שרירים (DMD)9,10,11,12,13,14,15. DMD זה X-linked רצסיבי מחלה קטלנית הנגרמת על ידי מוטציות בגן dmd, שמקודד הדיסטרופין החלבון16,17, להשפיע על אחד ב 3500 לידות זכר על פי ההקרנה היילוד18 , 19. הוא מאופיין על ידי חולשת שרירים פרוגרסיבית לבזבז. החולים DMD מאבדים בדרך כלל את היכולת ללכת בין 10 ל- 12 שנים של גיל למות מהתקף נשימה ו/או הלב כבר בגיל 20-30 שנים20. ראוי לציין, קרדיומיופתיה מתפתחת אצל > 90% של חולים DMD והוא מייצג המובילים לגרום מוות DMD חולים21,22. למרות Deflazacort (תרופה נגד דלקת), Eteplirsen (אקסון דילוג על רפואה שפיספסו אקסון 51) לאחרונה אושרו עבור DMD על ידי מזון, והתרופות האמריקני (FDA)23,24, אף אחד הטיפולים האלה לתקן את הפגם הגנטי ברמת הדנ א הגנומי. העכבר mdx, אשר נושאת מוטציה ב אקסון 23 של הדיסטרופין, כבר בשימוש נרחב כמו מודל DMD25. יתר על כן, בעבר להדגים כי הביטוי הדיסטרופין פונקציונלי שוחזר על ידי מחיקה בתוך מסגרת של ה-DNA גנומי כיסוי exons 21, 22 ו 23 בשרירי השלד של עכברים mdx באמצעות Ad-SpCas9/gRNA תוך שרירית משלוח9 , ואת השרירים הלב של mdx/utrophin+ /- עכברים באמצעות משלוח rAAVrh.74-SaCas9/gRNA תוך ורידי, בקרום הבטן26.
ב פרוטוקול זה, נתאר בפירוט בכל שלב בעריכת כמחנכת ג’ין הלב כדי לשחזר הדיסטרופין mdx/utrophin+ /- עכברים באמצעות וקטורים rAAVrh.74-SaCas9/gRNA, מ gRNA עיצוב הדיסטרופין לניתוח בסעיפים שריר הלב.
Protocol
Representative Results
Discussion
ב פרוטוקול זה, אנו מפרטים את כל השלבים הנחוצים להשגת ויוו ג’ין לב עריכה בעכברים כמחנכת באמצעות משלוח בתיווך rAAVrh.74 של SaCas9, בשתי gRNAs. כאמור, גישה זו יכול לשמש כדי לשחזר את הביטוי הדיסטרופין בעכברים dystrophic כפי שמתואר שלנו לעבוד27, אבל זה יכול גם לאפשר לימודי גנטיקה הפוכה מהירה של…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ר. ה נתמך על ידי ארצות הברית המכונים הלאומיים לבריאות מענקים (R01HL116546 ו- R01 AR064241).
Materials
| Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21428 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bio Safety Cabinets | Thermo Fisher Scientific | 1347 | 1300 Series A2 Class II, Type A2 |
| BsaI | New England BioLabs Inc | RO535S | |
| Competent cells | Agilent Technologies | 200314 | |
| Cell culture dishes, 150mm | Nest Scientific USA | 715001 | |
| Cryostat | Leica Biosystems | Leica CM3050S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | MT10017CV | Corning cellgro |
| Dystrophin antibody | Spring Bioscience | E2660 | |
| Fast-Ion Midi Plasmdi Kits | IBI Scientific | IB47111 | |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 26-140-079 | |
| Filter Unit, 0.45μm | Thermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| GoTaq Master Mixes | Promega | M7122 | |
| High-speed plasmid mini kit | IBI Scientific | IB47102 | |
| Horse serum | Abcam | ab139501 | |
| Isotemp 2239 Water Bath | Thermo Fisher Scientific | 15-460-11Q | |
| Isotemp Heat Block | Thermo Fisher Scientific | 11-718 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | LSM 780 | |
| LightCycler 480 instrument | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 Instrument II |
| Large Capacity Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46-910 | Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus |
| Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002445 | Sorvall Legend Micro 21R |
| Nanodrop spectrophotometers | Thermo Scientific | ND2000CLAPTOP | NanoDrop™ 2000/2000c |
| Oligos for i20-F | Integrated DNA Technologies | CACCgGGCGTTGAAATTCTCATTAC | |
| Oligos for i20-R | Integrated DNA Technologies | AAAC GTAATGAGAATTTCAACGCCc; | |
| Oligos for i23-F | Integrated DNA Technologies | CACCgCACCGATGAGAGGGAAAGGTC | |
| Oligos for i23-R | Integrated DNA Technologies | GACCTTTCCCTCTCATCGGTGc | |
| Oligos | Integrated DNA Technologies | ||
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | |
| OptiMEM | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | 89510-1kg-F | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966 | |
| Proteinase K | Sigma-Aldrich | P2308 | |
| Quick-Seal centrifuge tube | Beckman Coulter Inc | 342414 | |
| QIAquick Gel Extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| Radiant SYBR Green Hi-ROX qPCR Kits | Alkali Scientific | QS2005 | |
| RevertAid RT Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | K1691 | |
| Rotor | Beckman Coulter Inc | 337922 | Type 70Ti |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs Inc | M0202S | |
| Thermal Cycler | Bio-rad | 1861096 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc | 8043-30-1192 | Optima le-80k |
| Ultra centrifugal filter unit | MilliporeSigma | UFC510096 | |
| VECTASHIELD Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories, Inc | H-1200 |
Referências
- Makarova, K. S., Koonin, E. V. Annotation and Classification of CRISPR-Cas Systems. Methods Mol Biol. 1311, 47-75 (2015).
- Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163, 759-771 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339, 819-823 (2013).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339, 823-826 (2013).
- Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual review of biochemistry. 79, 181-211 (2010).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature protocols. 8, 2281-2308 (2013).
- Zhang, X., Wang, J., Cheng, Q., Zheng, X., Zhao, G. Multiplex gene regulation by CRISPR-ddCpf1. Cell discovery. 3, 17018 (2017).
- Zhang, X. H., Tee, L. Y., Wang, X. G., Huang, Q. S., Yang, S. H. Off-target Effects in CRISPR/Cas9-mediated Genome Engineering. Molecular therapy. Nucleic acids. 4, e264 (2015).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated genome editing restores dystrophin expression and function in mdx mice. Mol Ther. 24, 564-569 (2015).
- Long, C., et al. Postnatal genome editing partially restores dystrophin expression in a mouse model of muscular dystrophy. Science. 351, 400-403 (2016).
- Long, C. Z., et al. Prevention of muscular dystrophy in mice by CRISPR/Cas9-mediated editing of germline DNA. Science. 345, 1184-1188 (2014).
- Nelson, C. E., et al. In vivo genome editing improves muscle function in a mouse model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 351, 403-407 (2016).
- Ousterout, D. G. K., Thakore, A. M., Majoros, P. I., Reddy, T. E. W. H., Gersbach, C. A. Multiplex CRISPR/Cas9-based genome editing for correction of dystrophin mutations that cause Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 6, 6244 (2015).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Bengtsson, N. E., et al. Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editing ameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy. Nat Commun. 8, 14454 (2017).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Nowak, K. J., Davies, K. E. Duchenne muscular dystrophy and dystrophin: pathogenesis and opportunities for treatment. EMBO reports. 5, 872-876 (2004).
- Mendell, J. R., et al. Evidence-based path to newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Annals of neurology. 71, 304-313 (2012).
- Mendell, J. R., Lloyd-Puryear, M. Report of MDA muscle disease symposium on newborn screening for Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 48, 21-26 (2013).
- Spurney, C. F. Cardiomyopathy of Duchenne muscular dystrophy: current understanding and future directions. Muscle Nerve. 44, 8-19 (2011).
- Moriuchi, T., Kagawa, N., Mukoyama, M., Hizawa, K. Autopsy analyses of the muscular dystrophies. Tokushima J Exp Med. 40, 83-93 (1993).
- McNally, E. M. New approaches in the therapy of cardiomyopathy in muscular dystrophy. Annual review of medicine. 58, 75-88 (2007).
- Baker, D. E. Approvals, Submission, and Important Labeling Changes for US Marketed Pharmaceuticals. Hosp Pharm. 52, 306-307 (2013).
- Baker, D. E. Eteplirsen. Hosp Pharm. 52, 302-305 (2017).
- Sicinski, P., et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244, 1578-1580 (1989).
- Xu, L., et al. CRISPR-mediated Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Function in mdx Mice. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 24, 564-569 (2016).
- El Refaey, M., et al. In Vivo Genome Editing Restores Dystrophin Expression and Cardiac Function in Dystrophic Mice. Circ Res. 121, 923-929 (2017).
- Tabebordbar, M., et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 351, 407-411 (2016).
- Pozsgai, E. R., Griffin, D. A., Heller, K. N., Mendell, J. R., Rodino-Klapac, L. R. beta-Sarcoglycan gene transfer decreases fibrosis and restores force in LGMD2E mice. Gene therapy. 23, 57-66 (2016).
- Chicoine, L. G., et al. Plasmapheresis eliminates the negative impact of AAV antibodies on microdystrophin gene expression following vascular delivery. Mol Ther. 22, 338-347 (2014).
- Chicoine, L. G., et al. Vascular delivery of rAAVrh74.MCK.GALGT2 to the gastrocnemius muscle of the rhesus macaque stimulates the expression of dystrophin and laminin alpha2 surrogates. Mol Ther. 22, 713-724 (2014).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5, 407-415 (2015).
- Tsai, S. Q., et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. Nat Biotechnol. 33, 187-197 (2015).
