Summary

استكشاف ميكروبيومي الجذر: استخراج البيانات المجتمع البكتيرية من التربة، ورهيزوسفيري، واندوسفيري الجذر

Published: May 02, 2018
doi:

Summary

هنا، يمكننا وصف بروتوكول للحصول على بيانات تسلسل amplicon التربة ورهيزوسفيري وميكروبيوميس اندوسفيري الجذر. هذه المعلومات يمكن استخدامها للتحقيق في تركيبة وتنوع المجتمعات الميكروبية النباتية المرتبطة، وهي مناسبة للاستخدام مع مجموعة واسعة من الأنواع النباتية.

Abstract

التفاعل الحميم بين المضيف النبات والكائنات الحية الدقيقة المرتبطة بها أمر بالغ الأهمية في تحديد النبات اللياقة البدنية، ويمكن أن تعزز التسامح محسنة للضغوط غير الحيوية والأمراض. ميكروبيومي النباتية يمكن أن تكون معقدة للغاية، ومنخفضة التكلفة، غالباً ما أساليب الفائق مثل amplicon-على أساس تسلسل الجين الرنا الريباسي 16S المفضل لوصف تشكيلة الميكروبية والتنوع. اختيار المنهجية المناسبة عند إجراء مثل هذه التجارب غير ذات أهمية حاسمة للحد من التحيزات التي يمكن إجراء التحليل والمقارنة بين العينات والدراسات صعبة. ويصف هذا البروتوكول بالتفصيل منهجية موحدة لجمع واستخراج الحمض النووي من التربة ورهيزوسفيري، وعينات الجذر. بالإضافة إلى ذلك، تسلط الضوء على خط أنابيب تسلسل amplicon الرنا الريباسي 16S راسخة التي تسمح لاستكشاف تركيبة المجتمعات البكتيرية في هذه العينات، ويمكن تكييفها بسهولة لجينات علامة أخرى. هذا الخط قد تم التحقق من صحة لمجموعة متنوعة من أنواع النباتات، بما في ذلك الذرة، والذرة والقمح، والفراولة، والاغاف، ويمكن أن تساعد في التغلب على القضايا المرتبطة بالتلوث من العضيات النباتية.

Introduction

ميكروبيوميس المرتبطة بالنباتات تتكون من المجتمعات الميكروبية دينامية ومعقدة تتألف من البكتيريا، العتيقات، والفيروسات والفطريات وغيرها من الكائنات الدقيقة حقيقية النواة. بالإضافة إلى دورها مدروسة في التسبب في أمراض النباتات، الميكروبات المرتبطة بالنبات يمكن أيضا التأثير إيجابيا الصحة النباتية بتحسين التسامح الإجهادات الحيوية واللاحيويه وتعزيز توافر المغذيات، وتعزيز نمو النبات من خلال إنتاج فيتوهورمونيس. ولهذا السبب، يوجد اهتمام خاص في وصف الأصناف التي تربط بجذر نبات اندوسفيريس، ورهيزوسفيريس، والتربة المحيطة بها. بينما يمكن أن تكون بعض الميكروبات المستزرعة في عزلة في مختبر الوسائط التي تم إنشاؤها، كثير لا يمكن، جزئيا لأنها قد تعتمد على علاقات تكافلية مع غيرها الميكروبات، تنمو ببطء شديد، أو تتطلب الظروف التي لا يمكن تكرارها في بيئة معمل. لأنها تلتف الحاجة إلى زراعة وغير مكلفة نسبيا وعالية الإنتاجية، على أساس تسلسل النشوء والتطور التنميط العينات البيئية وما يرتبط بها المضيف الميكروبية أصبحت طريقة مفضلة للمعايرة المجتمع الميكروبي تكوين.

اختيار التكنولوجيات التسلسل الملائم توفيرها من قبل مختلف الجيل التالي التسلسل (خ ع) منصات1 يتوقف على احتياجات المستخدمين، مع العوامل الهامة بما في ذلك: التغطية المطلوبة، وطول أمبليكون، يتوقع المجتمع التنوع، فضلا عن تسلسل نسبة الخطأ، وطول القراءة، وفي التكلفة–كل–التشغيل/مجباس. هو متغير آخر يحتاج إلى النظر في التجارب المستندة إلى amplicon التسلسل سوف تفصيل ما هي الجينات، وسوف تستخدم كبسولة تفجير ما. عند تصميم أو اختيار الإشعال، كثيرا ما يجبر الباحثين جعل المفاضلات بين الطابع العالمي للتضخيم وقرار التقسيم يمكن تحقيقه من أمبليكونس الناتجة عن ذلك. ولهذا السبب، اختيار هذه الأنواع من الدراسات غالباً ما الإشعال وعلامات التي تستهدف مجموعات فرعية محددة ميكروبيومي بصورة انتقائية. تقييم تكوين المجتمعات البكتيرية شيوعاً أنجزه تسلسل واحد أو أكثر من مناطق هايبرفاريابل 16S البكتيرية الرنا الريباسي الجين2،3. في هذه الدراسة، يصف لنا أمبليكون أساس تسلسل البروتوكول وضع لمنصة خ ع تلك الأهداف 500 bp V3-V4 المنطقة الجينات الرنا الريباسي 16S البكتيرية، التي تسمح للتضخيم واسعة من الأنواع البكتيرية مع تقلب كافية لتوفير التمييز بين الأنواع المختلفة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن بسهولة أن هذا البروتوكول تطويعها للاستخدام مع مجموعات التمهيدي الأخرى، مثل تلك التي تستهدف علامة ITS2 للفطريات أو وحدة فرعية الرنا الريباسي 18S حقيقيات النوى.

بينما الآخر النهج مثل metagenomics بندقية، وميتاترانسكريبتوميكس، وتسلسل خلية واحدة، توفر مزايا أخرى بما في ذلك حل الجينومات الميكروبية والقياس المباشر أكثر من وظيفة المجتمع، هذه التقنيات عادة أكثر ووصف مكلفة ومكثفة حسابياً من التنميط النشوء والتطور هنا4. بالإضافة إلى ذلك، أداء metagenomics بندقية وميتاترانسكريبتوميكس على عينات الجذر غلة نسبة مئوية كبيرة من القراء الذين ينتمون إلى جينوم النبات المضيف، وأساليب للتغلب على هذا القيد لا يزال حاليا نمواً5،6.

كما هو الحال مع أي برنامج تجريبي، على أساس amplicon التنميط يمكن إدخال عدد من التحيزات المحتملة التي ينبغي أن ينظر فيها أثناء تحليل التصميم والبيانات التجريبية. وتشمل هذه الأساليب لجمع العينات، والحمض النووي استخراج وانتقاء من [بكر] كبسولة تفجير، وكيف يتم إعداد مكتبة. يمكن أن يؤثر تأثيراً كبيرا على كمية البيانات للاستخدام التي تم إنشاؤها بأساليب مختلفة، ويمكن أن يعوق الجهود المبذولة لمقارنة النتائج بين الدراسات. على سبيل المثال، الأسلوب لإزالة البكتيريا رهيزوسفيري7 واستخدام تقنيات الاستخراج مختلفة أو الاختيار من الحمض النووي استخراج مجموعات8،9 قد ثبت أن تأثير كبير تحليل المتلقين للمعلومات، الأمر الذي يؤدي إلى استنتاجات مختلفة فيما يتعلق بأي من الميكروبات الحاضر وعلى وفرة نسبية. حيث يمكن تخصيصها على أساس amplicon التنميط، أن إجراء مقارنات عبر الدراسات يمكن أن يكون تحديا. وقد اقترح المشروع ميكروبيومي الأرض استفادة الباحثين دراسة النظم المعقدة مثل ميكروبيومي المرتبطة بالنبات من تطوير بروتوكولات موحدة كوسيلة لتقليل التقلبات الناجمة عن تطبيق أساليب مختلفة بين الدراسات10،11. هنا، نحن مناقشة العديد من المواضيع المذكورة أعلاه وتقديم اقتراحات بشأن أفضل الممارسات بحيث المناسبة.

البروتوكول يوضح عملية جمع التربة، رهيزوسفيري، وعينات الجذر من السرغوم ذو لونين واستخراج الحمض النووي باستخدام الحمض النووي عزلة طقم راسخة11. بالإضافة إلى ذلك، لدينا بروتوكول يتضمن سير عمل تسلسل amplicon مفصلة، باستخدام منصة خ ع تستخدم عادة، لتحديد هيكل المجتمعات البكتيرية12،،من1314. وقد تم التحقق من هذا البروتوكول لاستخدامها في طائفة واسعة من مضيفي النباتات في دراسة نشرت مؤخرا من الجذور، رهيزوسفيري، والتربة المرتبطة 18 monocot الأنواع بما في ذلك السرغوم ذو لونين، ميس زيا، و قمح أيستيفوم15. هذا الأسلوب كما تم التحقق من للاستخدام مع جينات علامة أخرى، كما تجلى في التطبيق الناجح لدراسة الجينات علامة ITS2 الفطرية في دراسات الأغاف ميكروبيومي16،17 والفراولة ميكروبيومي 18.

Protocol

1-جمع وفصل من الجذر اندوسفيري، رهيزوسفيري، وعينات من التربة قبل الدخول إلى الميدان، اﻷوتوكﻻف الماء عالي النقاوة (على الأقل 90 مل مياه كل عينة) لتعقيم. إعداد الهوائي إزالة المخزن المؤقت (على الأقل 25 مل كل عينة) عن طريق إضافة 6.75 ز خ2ص4و 8.75 ز ك2هبو41 مل من X-100 تريتون، إ…

Representative Results

ينبغي أن يؤدي تنفيذ البروتوكول الموصى بها في مجموعة بيانات المفهرسة يقرأ نهاية الاقتران يمكن مطابقة مرة أخرى لكل عينة وتم تعيينها إلى أما البكتيريا الوحدات التصنيفية التشغيلية (أسامة) أو متغير التسلسل الدقيق (ESV، كما يشار إلى أمبليكون تسلسل البديل (ASV) ووحدة تصنيفية سوبو?…

Discussion

هذا البروتوكول يوضح خط أنابيب ثابتة لاستكشاف اندوسفيري الجذر، رهيزوسفيري، وتركيبة المجتمع الميكروبي التربة، من المعاينة الميدانية لتجهيز العينات وتسلسل المتلقين للمعلومات. دراسة ميكروبيوميس المرتبطة بجذور تحديات فريدة من نوعها، يرجع جزئيا إلى الصعوبات الكامنة في أخذ العينات من الترب…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة الزراعة-جمعية الإغاثة اﻷرمنية (كريس 2030-21430-008-00D). الملخص معتمد من قبل “برنامج زمالة بحوث الدراسات العليا جبهة الخلاص الوطني”.

Materials

0.1-10/20 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-3810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000027 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes Eppendorf 3120000909 Can substitute with equivalent from other suppliers.
100 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000043 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1000 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1122-1830 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1620-2700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mm soil sieve Forestry Suppliers 60141009 Can substitute with equivalent from other suppliers.
200 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-8810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
25 mL reservoirs VWR International LLC 89094-664 Can substitute with equivalent from other suppliers.
50 mL conical vials Thermo Fisher Scientific 352098 Can substitute with equivalent from other suppliers.
500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) VWR International LLC 156-4020
96-well microplates USA Scientific 655900
96-well PCR plates BioRad HSP9631
Agencourt AMPure XP beads Thermo Fisher Scientific NC9933872 Instructions for use:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180&documentName=B37419AA.pdf
Aluminum foil Boardwalk 7124 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Analytical scale with 0.001 g resolution Ohaus Pioneer PA323 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Bioruptor Plus ultrasonicator Diagenode B01020001
Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL New England Biolabs B9000S
Centrifuge Eppendorf 5811000908 Including 50mL and 96-well plate bucket adapters
Cryogenic gloves Millipore Sigma Z183490 Can substitute with equivalent from other suppliers.
DNeasy PowerClean kit (optional) Qiagen Inc. 12877-50 Previously MoBio
DNeasy PowerSoil kit Qiagen Inc. 12888-100 Previously MoBio
Dry ice Any NA
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher Scientific 12321D Do not substitute
Ethanol VWR International LLC 89125-188 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gallon size freezer bags Ziploc NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gemini EM Microplate Reader Molecular Devices EM Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top.
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Lab coat Workrite J1367 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 Any NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 dewar Thermo Fisher Scientific 4150-9000 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Milli-Q ultrapure water purification system Millipore Sigma SYNS0R0WW
Mini-centrifuge Eppendorf 5404000014
Molecular grade water Thermo Fisher Scientific 4387937 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Mortars VWR International LLC 89038-150 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Nitrile gloves Thermo Fisher Scientific 19167032B Can substitute with equivalent from other suppliers.
Paper towels VWR International LLC BWK6212 Can substitute with equivalent from other suppliers.
PCR plate sealing film Thermo Fisher Scientific NC9684493
PCR strip tubes USA Scientific 1402-2700
Pestles VWR International LLC 89038-166 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Plastic spatulas LevGo, Inc. 17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) Thermo Fisher Scientific 13000014
PNAs – chloroplast and mitochondrial PNA Bio NA Make sure to verify sequence bioinformatically
Protective eyewear Millipore Sigma Z759015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Qubit 3.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Qubit dsDNA HS assay kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Rubber mallet (optional) Ace Hardware 2258622 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shears or scissors VWR International LLC 89259-936 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shovel Home Depot 2597400 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Soil core collector (small diameter: <1 inch) Ben Meadows 221700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Spray bottles Santa Cruz Biotechnology sc-395278 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) IDT NA 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry.
Thermocycler Thermo Fisher Scientific E950040015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Weigh boats Spectrum Chemicals B6001W Can substitute with equivalent from other suppliers.

Referências

  1. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
  2. Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences. ISME J. 6 (7), 1440-1444 (2012).
  3. Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing. PLoS One. 9 (8), e105592 (2014).
  4. Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PLoS One. 9 (4), e93827 (2014).
  5. Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front Plant Sci. 5, 209 (2014).
  6. Jiao, J. -. Y., Wang, H. -. X., Zeng, Y., Shen, Y. -. M. Enrichment for microbes living in association with plant tissues. J Appl Microbiol. 100 (4), 830-837 (2006).
  7. Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Front Microbiol. 7, 773 (2016).
  8. Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).
  9. Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
  10. Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLoS Biol. 15 (3), e2001793 (2017).
  11. Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth’s multiscale microbial diversity. Nature. , (2017).
  12. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  13. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform. Appl Environ Microb. 79 (17), 5112-5120 (2013).
  14. Degnan, P. H., Ochman, H. Illumina-based analysis of microbial community diversity. ISME J. 6 (1), 183-194 (2012).
  15. Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome. ISME J. , (2017).
  16. Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species. FEMS Microbiol Ecol. 90 (3), 844-857 (2014).
  17. Coleman-Derr, D., et al. Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytol. 209 (2), 798-811 (2016).
  18. De Tender, C., et al. Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection. Front Microbiol. 7, 2062 (2016).
  19. Kapp, J. R., et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 68 (2), 111-118 (2015).
  20. Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
  21. O’Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J Phys Conf Ser. 307 (1), 012047 (2011).
  22. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  23. Amir, A., et al. Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns. mSystems. 2 (2), e00191-e00116 (2017).
  24. Edgar, R. C. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv. , 081257 (2016).
  25. Nguyen, N. -. P., Warnow, T., Pop, M., White, B. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004 (2016).
  26. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. , (2017).
  27. Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nat Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
  28. O’Brien, S. L., et al. Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity. Environ Microbiol. 18 (6), 2039-2051 (2016).
  29. Fierer, N., Lennon, J. T. The generation and maintenance of diversity in microbial communities. Am J Bot. 98 (3), 439-448 (2011).
  30. Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 15 (10), 579-590 (2017).
  31. Buckley, D. H., Schmidt, T. M. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol. 5 (6), 441-452 (2003).
  32. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
  33. Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
  34. Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid. Croat Med J. 46 (4), 556-562 (2005).
  35. Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics. Electrophoresis. 29 (7), 1467-1472 (2008).
  36. Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities. PeerJ. 3, e804 (2015).
  37. Bogas, A. C., et al. Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose. Springerplus. 4, 258 (2015).
  38. Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. Priority effects during fungal community establishment in beech wood. ISME J. 9 (10), 2246-2260 (2015).
  39. Zhang, T., Yao, Y. -. F. Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific. PLoS One. 10 (6), e0130051 (2015).
  40. Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. PLoS One. 8 (8), e71360 (2013).
  41. Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity. Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).
  42. Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -. A. Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems. Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).
  43. Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -. Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 17, 135 (2016).
check_url/pt/57561?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Simmons, T., Caddell, D. F., Deng, S., Coleman-Derr, D. Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere. J. Vis. Exp. (135), e57561, doi:10.3791/57561 (2018).

View Video