JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Genética

Utforske rot Microbiome: utpakking bakterielle samfunnet Data fra jord, Rhizosphere og rot Endosphere

Published: May 02, 2018
doi:
10.3791/57561
, , ,
1Department of Plant and Microbial Biology,University of California, Berkeley, 2Plant Gene Expression Center,USDA ARS

Summary

Her beskriver vi en protokoll for å få amplicon sekvens databehandling jord, rhizosphere og rot endosphere microbiomes. Denne informasjonen kan brukes til å undersøke komposisjon og mangfoldet av plante-assosiert mikrobielle samfunn, og er egnet for bruk med en rekke forskjellige plantearter.

Abstract

Intime samspillet mellom anlegget vert og tilknyttede mikroorganismer er avgjørende anlegget fitness, og kan fremme forbedret toleranse til abiotiske stress og sykdommer. Som anlegg microbiome kan være svært komplekse, lave kostnader, er høy gjennomstrømming metoder som amplicon-baserte sekvensering av 16S rRNA genet ofte foretrukket for karakteriserer sin mikrobiell sammensetning og mangfold. Valg av riktig metode når du utfører slike eksperimenter er imidlertid avgjørende for å redusere fordommer som kan gjøre analyse og sammenligninger mellom prøver og studier vanskelig. Denne protokollen beskriver i detalj en standardisert metode for innsamling og utvinning av DNA fra jord, rhizosphere og roten prøver. I tillegg vi markere en veletablert 16S rRNA amplicon sekvensering rørledning som gjør utforskning av sammensetningen av bakteriell samfunn i prøvene, og kan lett tilpasses for andre markør gener. Denne rørledningen er validert for forskjellige plantearter, inkludert sorghum, mais, hvete, jordbær og agave, og kan bidra til overvinne problemer forbundet med forurensning fra anlegget organeller.

Introduction

Plante-assosiert microbiomes består av dynamisk og komplekse mikrobielle samfunn som består av bakterier, archaea, virus, sopp og andre eukaryotic mikroorganismer. I tillegg til sine godt studert rolle i forårsaker plante sykdom, kan plante-assosiert mikrober positivt påvirke plante helse forbedre toleranse biotiske og abiotiske påkjenninger, fremmer nærings tilgjengelighet og styrke plantevekst gjennom produksjon av phyto-hormoner. Derfor finnes særlig interesse i karakteriserer taxa som knytter plante rot endospheres, rhizospheres og det omkringliggende jorden. Mens noen mikrober kan kultivert isolert på laboratoriet generert media, kan mange delvis fordi de kan stole på symbiotiske forholdet med andre mikrober, vokser svært sakte, eller krever betingelser som ikke kan bli kopiert i et laboratoriemiljø. Fordi det omgår behovet for dyrking og er relativt billig og høy gjennomstrømming, blitt sekvens-baserte Fylogenetiske profilering av environmental og verts-assosiert mikrobiell prøver foretrukket metode for assaying mikrobielle samfunn komposisjon.

Valg av aktuell sekvensering teknologi fra ulike neste generasjons sekvensering (NGS) plattformer1 er avhengig av brukernes behov, med viktige faktorer inkludert: ønsket dekning, amplicon lengde, forventet samfunnet mangfold, samt sekvensering feil, lese-lengde og kostnad-per-run/megabase. En annen variabel som må vurderes i amplicon-baserte sekvensering eksperimenter er hva gene vil bli forsterket og hva primere skal brukes. Når du utformer eller velge primere, er forskere ofte tvunget foreta avveininger mellom universalitet forsterkning og taksonomisk oppløsningen oppnåelige fra den resulterende amplicons. Derfor valgte slike studier ofte primere og markører som selektivt målrette bestemte delsett av microbiome. Evaluere sammensetningen av bakteriell samfunn oppnås vanligvis ved sekvensering ett eller flere av regionene hypervariable bakteriell 16S rRNA gen2,3. I denne studien, beskriver vi en amplicon basert sekvensering protokoll utviklet for en NGS plattform mål 500 bp V3 V4 regionen av bakteriell 16S rRNA genet, som gir bred forsterkning av bakteriell taxa gir nok variasjon til skille mellom forskjellige taxa. I tillegg kan denne protokollen lett tilpasses for bruk med andre primer sett, som de målretting ITS2 markør for sopp eller 18S rRNA delenhet i eukaryoter.

Mens andre tilnærminger som hagle metagenomics, metatranscriptomics og encellede sekvensering, tilbyr andre fordeler inkludert løst mikrobiell genomes og mer direkte måling av samfunnet funksjonen, er disse teknikkene vanligvis mer dyrt og beregningsmessig intensiv enn Fylogenetiske profilering beskrevet her4. I tillegg utfører hagle metagenomics og metatranscriptomics på roten prøver gir en stor del av leser tilhører verten anlegget genomet, og metoder for å overkomme denne begrensningen er stadig utviklet5,6.

Som med alle eksperimentelle plattformer, kan amplicon-baserte profilering introdusere en rekke potensielle skjevheter som bør vurderes under eksperimentell design og data analysen. Disse omfatter metoder for prøvetaking, DNA ekstrahering, utvalg av PCR primere, og hvordan biblioteket forberedelse utføres. Metoder kan betydelig påvirke mengden brukbare data generert, og kan også hindre innsatsen sammenligne resultater mellom studier. For eksempel metoden å fjerne rhizosphere bakterier7 og bruk av ulike utvinning teknikker eller valg av DNA utvinning kits8,9 har vist betydelig innvirkning nedstrøms analyse, som fører til ulike konklusjoner om som mikrober er tilstede og deres relative antall. Siden amplicon-baserte profilering kan tilpasses, kan foreta sammenligninger over studier være utfordrende. Den jorden Project Microbiome har foreslått at forskere studere komplekse systemer som plante-assosiert microbiome ville ha nytte av utviklingen av standardiserte protokoller som en måte å minimere variasjon forårsaket av anvendelsen av ulike metoder mellom studier10,11. Her diskuterer vi mange av emnene over og tilby forslag til best praksis hvor hensiktsmessig.

Protokoll viser prosessen med å samle jord, rhizosphere og roten prøver fra endringer og utdrager DNA ved hjelp av en veletablert DNA isolering kit11. I tillegg inneholder våre protokollen en detaljert amplicon sekvensering arbeidsflyt, bruker en vanligvis benyttet NGS plattform, til å bestemme strukturen av bakteriell samfunn12,13,14. Denne protokollen er validert for bruk i en rekke anlegget verter i en nylig publisert studie av røtter, rhizosphere og tilknyttet jord av 18 monocot arter inkludert endringer, Zea mays, og Triticum aestivum15. Denne metoden har også blitt godkjent for bruk med andre markør gener, som demonstrert av vellykkede programmet å studere fungal ITS2 markør genet i studier av agave microbiome16,17 og jordbær microbiome 18.

Protocol

1. innsamling og separasjon av roten Endosphere, Rhizosphere og jordprøver Før inn feltet autoklav ultrapure vann (minst 90 mL vann per eksempel) å sterilisere. Forberede epiphyte fjerning buffer (minst 25 mL per prøve) ved å legge 6.75 g KH2PO4, 8.75 g K2HPO4og 1 mL av Triton X-100, 1 L sterilt vann. Sterilisere bufferen med et vakuum filter med 0,2 µm porestørrelse. Hva 1.2 til 1,5, bruk ren hansker sterilisert med etanol hele tiden og erstatte hanske…

Representative Results

Utføre det anbefalte protokollen skal resultere i et dataset indekserte sammen-end lyder som kan matchet tilbake til hvert utvalg og tilordnet enten en bakteriell taksonomisk driftsenheter (OTU) eller eksakte sekvensen variant (ESV, også referert til som amplicon sekvensen variant (ASV) og sub-operational taksonomisk enhet (sOTU)), avhengig av nedstrøms. For å få høy kvalitet sekvens databehandling, må utvises på hvert trinn å opprettholde konsekvensen mellom prøvene og minimere…

Discussion

Denne protokollen demonstrerer en etablert rørledning for å utforske roten endosphere, rhizosphere og jord mikrobiell samfunnet komposisjoner, fra feltet prøvetaking prøve behandling og nedstrøms sekvensering. Studere rot-assosiert microbiomes gir unike utfordringer, skyldes delvis til iboende vanskeligheter i prøvetaking fra jord. Jordsmonnet er svært variabel i form av fysiske og kjemiske egenskaper, og ulike jordbunnsforhold kan skilles med så lite som noen få millimeter28,<…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble finansiert av USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS støttes av NSF Graduate Fellowship forskningsprogrammet.

Materials

0.1-10/20 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-3810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000027 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes Eppendorf 3120000909 Can substitute with equivalent from other suppliers.
100 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000043 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1000 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1122-1830 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1620-2700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mm soil sieve Forestry Suppliers 60141009 Can substitute with equivalent from other suppliers.
200 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-8810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
25 mL reservoirs VWR International LLC 89094-664 Can substitute with equivalent from other suppliers.
50 mL conical vials Thermo Fisher Scientific 352098 Can substitute with equivalent from other suppliers.
500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) VWR International LLC 156-4020
96-well microplates USA Scientific 655900
96-well PCR plates BioRad HSP9631
Agencourt AMPure XP beads Thermo Fisher Scientific NC9933872 Instructions for use:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180&documentName=B37419AA.pdf
Aluminum foil Boardwalk 7124 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Analytical scale with 0.001 g resolution Ohaus Pioneer PA323 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Bioruptor Plus ultrasonicator Diagenode B01020001
Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL New England Biolabs B9000S
Centrifuge Eppendorf 5811000908 Including 50mL and 96-well plate bucket adapters
Cryogenic gloves Millipore Sigma Z183490 Can substitute with equivalent from other suppliers.
DNeasy PowerClean kit (optional) Qiagen Inc. 12877-50 Previously MoBio
DNeasy PowerSoil kit Qiagen Inc. 12888-100 Previously MoBio
Dry ice Any NA
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher Scientific 12321D Do not substitute
Ethanol VWR International LLC 89125-188 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gallon size freezer bags Ziploc NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gemini EM Microplate Reader Molecular Devices EM Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top.
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Lab coat Workrite J1367 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 Any NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 dewar Thermo Fisher Scientific 4150-9000 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Milli-Q ultrapure water purification system Millipore Sigma SYNS0R0WW
Mini-centrifuge Eppendorf 5404000014
Molecular grade water Thermo Fisher Scientific 4387937 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Mortars VWR International LLC 89038-150 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Nitrile gloves Thermo Fisher Scientific 19167032B Can substitute with equivalent from other suppliers.
Paper towels VWR International LLC BWK6212 Can substitute with equivalent from other suppliers.
PCR plate sealing film Thermo Fisher Scientific NC9684493
PCR strip tubes USA Scientific 1402-2700
Pestles VWR International LLC 89038-166 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Plastic spatulas LevGo, Inc. 17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) Thermo Fisher Scientific 13000014
PNAs – chloroplast and mitochondrial PNA Bio NA Make sure to verify sequence bioinformatically
Protective eyewear Millipore Sigma Z759015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Qubit 3.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Qubit dsDNA HS assay kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Rubber mallet (optional) Ace Hardware 2258622 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shears or scissors VWR International LLC 89259-936 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shovel Home Depot 2597400 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Soil core collector (small diameter: <1 inch) Ben Meadows 221700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Spray bottles Santa Cruz Biotechnology sc-395278 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) IDT NA 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry.
Thermocycler Thermo Fisher Scientific E950040015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Weigh boats Spectrum Chemicals B6001W Can substitute with equivalent from other suppliers.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
  2. Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences. ISME J. 6 (7), 1440-1444 (2012).
  3. Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing. PLoS One. 9 (8), e105592 (2014).
  4. Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PLoS One. 9 (4), e93827 (2014).
  5. Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front Plant Sci. 5, 209 (2014).
  6. Jiao, J. -. Y., Wang, H. -. X., Zeng, Y., Shen, Y. -. M. Enrichment for microbes living in association with plant tissues. J Appl Microbiol. 100 (4), 830-837 (2006).
  7. Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Front Microbiol. 7, 773 (2016).
  8. Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).
  9. Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
  10. Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLoS Biol. 15 (3), e2001793 (2017).
  11. Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth’s multiscale microbial diversity. Nature. , (2017).
  12. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  13. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform. Appl Environ Microb. 79 (17), 5112-5120 (2013).
  14. Degnan, P. H., Ochman, H. Illumina-based analysis of microbial community diversity. ISME J. 6 (1), 183-194 (2012).
  15. Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome. ISME J. , (2017).
  16. Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species. FEMS Microbiol Ecol. 90 (3), 844-857 (2014).
  17. Coleman-Derr, D., et al. Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytol. 209 (2), 798-811 (2016).
  18. De Tender, C., et al. Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection. Front Microbiol. 7, 2062 (2016).
  19. Kapp, J. R., et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 68 (2), 111-118 (2015).
  20. Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
  21. O’Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J Phys Conf Ser. 307 (1), 012047 (2011).
  22. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  23. Amir, A., et al. Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns. mSystems. 2 (2), e00191-e00116 (2017).
  24. Edgar, R. C. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv. , 081257 (2016).
  25. Nguyen, N. -. P., Warnow, T., Pop, M., White, B. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004 (2016).
  26. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. , (2017).
  27. Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nat Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
  28. O’Brien, S. L., et al. Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity. Environ Microbiol. 18 (6), 2039-2051 (2016).
  29. Fierer, N., Lennon, J. T. The generation and maintenance of diversity in microbial communities. Am J Bot. 98 (3), 439-448 (2011).
  30. Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 15 (10), 579-590 (2017).
  31. Buckley, D. H., Schmidt, T. M. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol. 5 (6), 441-452 (2003).
  32. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
  33. Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
  34. Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid. Croat Med J. 46 (4), 556-562 (2005).
  35. Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics. Electrophoresis. 29 (7), 1467-1472 (2008).
  36. Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities. PeerJ. 3, e804 (2015).
  37. Bogas, A. C., et al. Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose. Springerplus. 4, 258 (2015).
  38. Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. Priority effects during fungal community establishment in beech wood. ISME J. 9 (10), 2246-2260 (2015).
  39. Zhang, T., Yao, Y. -. F. Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific. PLoS One. 10 (6), e0130051 (2015).
  40. Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. PLoS One. 8 (8), e71360 (2013).
  41. Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity. Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).
  42. Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -. A. Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems. Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).
  43. Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -. Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 17, 135 (2016).

Tags

Root MicrobiomeSoilRhizosphereRoot Endosphere16S Ribosomal RNA GeneCommunity ProfilingMicrobial EcologyDNA ExtractionSequencing LibrarySoil CoreRhizosphere SeparationRoot WashingDNA Extraction
check_url/pt/57561?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Simmons, T., Caddell, D. F., Deng, S., Coleman-Derr, D. Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere. J. Vis. Exp. (135), e57561, doi:10.3791/57561 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image