Summary

Utforska den roten mikrobiomet: extrahera bakteriell gemenskapen Data från jord, odlingsbädden och rot Endosphere

Published: May 02, 2018
doi:

Summary

Här beskriver vi ett protokoll för att erhålla amplikon sekvensdata av jord, odlingsbädden och rot endosphere microbiomes. Denna information kan användas för att undersöka den sammansättning och mångfalden av växt-associerade mikrobiella samhällen, och är lämplig för användning med ett brett utbud av växtarter.

Abstract

Intima samspelet mellan anläggning värd och associerade mikroorganismer är avgörande för att fastställa växt fitness, och kan främja förbättrad tolerans mot abiotisk stress och sjukdomar. Den växten mikrobiomet kan vara mycket komplexa, låg kostnad, är hög genomströmning metoder såsom amplikon-baserade sekvensering av 16S rRNA-genen ofta föredra för att karakterisera dess mikrobiell komposition och mångfald. Valet av lämplig metodik när genomföra sådana experiment är dock avgörande för att minska fördomar som kan försvåra analys och jämförelser mellan prover och undersökningar. Det här protokollet beskriver i detalj en standardiserad metod för insamling och extraktion av DNA från jord, odlingsbädden och rot prover. Dessutom, vi lyfter fram en väletablerad 16S rRNA amplikon sekvensering pipeline som möjliggör utforskandet av sammansättningen av bakteriella samhällen i dessa prover, och kan enkelt anpassas för andra markörgener. Denna pipeline har validerats för en mängd växtarter, inklusive sorghum, majs, vete, jordgubb och agave, och kan bidra till att lösa frågor i samband med föroreningen från växten organeller.

Introduction

Växt-associerad microbiomes består av dynamiska och komplexa mikrobiella samhällen består av bakterier, arkéer, virus, svampar och andra eukaryota mikroorganismer. Utöver deras väl studerat roll i orsakar växtsjukdomar, kan växt-associerade mikrober också positivt påverka växtskydd genom att förbättra tolerans mot biotiska och abiotiska påfrestningar, främja näringsämnen tillgänglighet och förbättra växternas tillväxt genom produktionen av fytohormoner. Av denna anledning finns särskilt intresse i karaktärisera de taxa som förknippar med växt rot endospheres, rhizospheres och den omgivande marken. Medan vissa mikrober kan vara odlade i isolering på laboratoriet genererade media, många inte, delvis eftersom de kan lita på symbiotiska relationer med andra mikrober, växer mycket långsamt, eller kräva villkor som inte kan replikeras i en labbmiljö. Eftersom det kringgår behovet av odling och är relativt billig och hög genomströmning, har sekvens-baserade fylogenetiska profilering av miljö- och host-associerade mikrobiell prover blivit en rekommenderad metod för testmetoder mikrobiell gemenskapen sammansättning.

Valet av lämpliga sekvensering teknik som tillhandahålls av olika nästa generation sequencing (NGS) plattformar1 är beroende av användarnas behov, med viktiga faktorer inklusive: önskad täckning, amplikon längd, förväntat gemenskapen mångfald, samt sekvensering felprocenten, Läs-längd och den kostnad-per-kör/megabase. En annan variabel som måste beaktas i amplikon-baserade sekvensering experiment är vilken gen kommer att förstärkas och vilken grundfärg ska användas. När du designar eller välja primers, tvingas forskare ofta göra kompromisser mellan amplifiering universalitet och taxonomisk upplösning kan uppnås från den resulterande amplikoner. Av denna anledning valde dessa typer av studier ofta primers och markörer för att selektivt riktar specifika delmängder av mikrobiomet. Utvärdera sammansättningen av bakteriella samhällen sker vanligen genom sekvensering en eller flera av de bakteriella 16S rRNA gen2,3hypervariabel regioner. I denna studie, beskriver vi en amplikon baserat sekvensering protokoll som utvecklats för en NGS plattform mål 500 bp V3-V4 regionen av bakteriell 16S rRNA genen, vilket möjliggör bred förstärkning av bakteriell taxa samtidigt ge tillräcklig variation till skilja mellan olika taxa. Detta protokoll kan dessutom enkelt anpassas för användning med andra primer uppsättningar, som riktar sig till den ITS2 markören av svampar eller den 18S rRNA subuniten av eukaryotes.

Medan andra metoder såsom hagelgevär metagenomik, metatranscriptomics och encelliga sekvensering, erbjuder andra fördelar inklusive löst mikrobiell genomen och mer direkt mätning av gemenskapens funktion, är dessa tekniker vanligtvis mer dyrt och arbetsintensivt än fylogenetiska profilering beskrivs här4. Dessutom utför hagelgevär metagenomik och metatranscriptomics på roten prover ger en stor andel av läsningar som hör till den mottagande anläggning arvsmassan, och metoder för att övervinna denna begränsning fortfarande är utvecklade5,6.

Som med alla experimentell plattform, kan amplikon-baserade profilering införa ett antal potentiella fördomar som bör övervägas under den experimentella design och dataanalys. Dessa inkluderar metoder för provtagning, DNA extraktion, urval av PCR primers och hur biblioteket beredning utförs. Olika metoder kan avsevärt påverka mängden användbara data som genereras, och kan också hindra ansträngningarna att jämföra resultat mellan studierna. Till exempel metoden för att avlägsna odlingsbädden bakterier7 och användningen av olika utvinning tekniker eller val av DNA extraktion kit8,9 har visat sig signifikant inverkan nedströms analys, vilket leder till olika slutsatser om vilka mikrober är närvarande och deras relativa förekomsten. Eftersom amplikon-baserade profilering kan anpassas, kan det vara svårt att göra jämförelser mellan studierna. Jorden mikrobiomet projektet har föreslagit att forskare studerar komplexa system som den växt-associerade mikrobiomet skulle gynnas utvecklingen av standardiserade protokoll som ett medel för att minimera variabiliteten orsakas av tillämpningen av olika metoder mellan studier10,11. Här diskuterar vi många av de ovanstående ämnena och ge förslag om bästa praxis där så är lämpligt.

Protokollet visar processen för samlande jord, odlingsbädden och rot prover från Sorghum bicolor och utvinna DNA med en väletablerad DNA isolering kit11. Våra protokoll innehåller dessutom en detaljerad amplikon sekvensering arbetsflöde, med en ofta utnyttjad NGS platform, för att bestämma strukturen av bakteriesamhällen12,13,14. Detta protokoll har validerats för användning i ett brett utbud av växten varar värd i en nyligen publicerad studie av rötter, odlingsbädden och associerade-smutsar av 18 enhjärtbladiga arter inklusive Sorghum bicolor, Zea mays, och Triticum aestivum15. Denna metod har också validerats för användning med andra markörgener, vilket framgår av dess framgångsrika för att studera genen svamp ITS2 markör i studier av agave mikrobiomet16,17 och strawberry mikrobiomet 18.

Protocol

1. insamling och Separation av roten Endosphere, odlingsbädden och jordprover Innan fältet, autoklav ultrarent vatten (minst 90 mL vatten per prov) för att sterilisera. Förbereda epifyt borttagning buffert (minst 25 mL per prov) genom att lägga till 6,75 g KH2PO4, 8.75 g K2HPO4och 1 mL av Triton x-100, 1 L sterilt vatten. Sterilisera bufferten med ett vakuum filter med 0,2 µm porstorlek. För steg 1,2 till 1,5, Använd rena handskar steriliseras med etan…

Representative Results

Utföra det rekommenderade protokollet bör resultera i en datamängd av indexerade Parade-end läser som kan matchas till varje prov och tilldelats antingen en bakteriell operativa taxonomiska enheter (OTU) eller exakta sekvens variant (ESV, även kallad amplikon sekvens variant (ASV) och sub-operational taxonomiska enheten (sOTU)), beroende på efterföljande analys. För att få hög kvalitet sekvensdata, måste försiktighet iakttas vid varje steg att behålla överensstämmelsen mell…

Discussion

Detta protokoll visar en etablerad rörledning för att utforska rot endosphere, odlingsbädden och jord mikrobiell gemenskapen kompositioner, från fältprovtagning prov bearbetning och efterföljande sekvensering. Studerar rot-associerad microbiomes presenterar unika utmaningar, vederbörlig delvis inneboende svårigheterna att provtagning från marken. Jordar är mycket variabel i form av fysiska och kemiska egenskaper och olika markförhållanden kan separeras från så lite som några millimeter28<…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete finansierades av USDA-ARS (CRIS 2030-21430-008-00D). TS stöds av NSF Graduate Research Fellowship-programmet.

Materials

0.1-10/20 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-3810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1.5 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1615-5510 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000027 Can substitute with equivalent from other suppliers.
10 µL, 100 µL, and 1000 µL micropipettes Eppendorf 3120000909 Can substitute with equivalent from other suppliers.
100 µL multi-channel pipette Eppendorf 3122000043 Can substitute with equivalent from other suppliers.
1000 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1122-1830 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mL microcentrifuge tubes USA Scientific 1620-2700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
2 mm soil sieve Forestry Suppliers 60141009 Can substitute with equivalent from other suppliers.
200 µL filtered micropipette tips USA Scientific 1120-8810 Can substitute with equivalent from other suppliers.
25 mL reservoirs VWR International LLC 89094-664 Can substitute with equivalent from other suppliers.
50 mL conical vials Thermo Fisher Scientific 352098 Can substitute with equivalent from other suppliers.
500 mL vacuum filters (0.2 µm pore size) VWR International LLC 156-4020
96-well microplates USA Scientific 655900
96-well PCR plates BioRad HSP9631
Agencourt AMPure XP beads Thermo Fisher Scientific NC9933872 Instructions for use:
https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/ajax/downloadDocument/B37419AA.pdf?autonomyId=TP_DOC_150180&documentName=B37419AA.pdf
Aluminum foil Boardwalk 7124 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Analytical scale with 0.001 g resolution Ohaus Pioneer PA323 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Bioruptor Plus ultrasonicator Diagenode B01020001
Bovine Serum Albumin (BSA) 20 mg/mL New England Biolabs B9000S
Centrifuge Eppendorf 5811000908 Including 50mL and 96-well plate bucket adapters
Cryogenic gloves Millipore Sigma Z183490 Can substitute with equivalent from other suppliers.
DNeasy PowerClean kit (optional) Qiagen Inc. 12877-50 Previously MoBio
DNeasy PowerSoil kit Qiagen Inc. 12888-100 Previously MoBio
Dry ice Any NA
DynaMag-2 magnet Thermo Fisher Scientific 12321D Do not substitute
Ethanol VWR International LLC 89125-188 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gallon size freezer bags Ziploc NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Gemini EM Microplate Reader Molecular Devices EM Can use another fluorometer that reads 96-well plates from the top.
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Lab coat Workrite J1367 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 Any NA Can substitute with equivalent from other suppliers.
Liquid N2 dewar Thermo Fisher Scientific 4150-9000 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Milli-Q ultrapure water purification system Millipore Sigma SYNS0R0WW
Mini-centrifuge Eppendorf 5404000014
Molecular grade water Thermo Fisher Scientific 4387937 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Mortars VWR International LLC 89038-150 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Nitrile gloves Thermo Fisher Scientific 19167032B Can substitute with equivalent from other suppliers.
Paper towels VWR International LLC BWK6212 Can substitute with equivalent from other suppliers.
PCR plate sealing film Thermo Fisher Scientific NC9684493
PCR strip tubes USA Scientific 1402-2700
Pestles VWR International LLC 89038-166 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Plastic spatulas LevGo, Inc. 17211
Platinum Hot Start PCR Master Mix (2x) Thermo Fisher Scientific 13000014
PNAs – chloroplast and mitochondrial PNA Bio NA Make sure to verify sequence bioinformatically
Protective eyewear Millipore Sigma Z759015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Qubit 3.0 Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Qubit dsDNA HS assay kit Thermo Fisher Scientific Q32854
Rubber mallet (optional) Ace Hardware 2258622 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shears or scissors VWR International LLC 89259-936 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Shovel Home Depot 2597400 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Soil core collector (small diameter: <1 inch) Ben Meadows 221700 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Spray bottles Santa Cruz Biotechnology sc-395278 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Standard desalted barcoded primers (10 µM) (Table 1) IDT NA 4 nmole Ultramer DNA Oligo with standard desalting. NGS adapter and sequencing primer (Table 1) are designed for use with Illumina MiSeq using v3 chemistry.
Thermocycler Thermo Fisher Scientific E950040015 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Can substitute with equivalent from other suppliers.
Weigh boats Spectrum Chemicals B6001W Can substitute with equivalent from other suppliers.

Referências

  1. Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nat Rev Genet. 17 (6), 333-351 (2016).
  2. Soergel, D. A. W., Dey, N., Knight, R., Brenner, S. E. Selection of primers for optimal taxonomic classification of environmental 16S rRNA gene sequences. ISME J. 6 (7), 1440-1444 (2012).
  3. Takahashi, S., Tomita, J., Nishioka, K., Hisada, T., Nishijima, M. Development of a Prokaryotic Universal Primer for Simultaneous Analysis of Bacteria and Archaea Using Next-Generation Sequencing. PLoS One. 9 (8), e105592 (2014).
  4. Poretsky, R., Rodriguez-R, L. M., Luo, C., Tsementzi, D., Konstantinidis, K. T. Strengths and Limitations of 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing in Revealing Temporal Microbial Community Dynamics. PLoS One. 9 (4), e93827 (2014).
  5. Sharpton, T. J. An introduction to the analysis of shotgun metagenomic data. Front Plant Sci. 5, 209 (2014).
  6. Jiao, J. -. Y., Wang, H. -. X., Zeng, Y., Shen, Y. -. M. Enrichment for microbes living in association with plant tissues. J Appl Microbiol. 100 (4), 830-837 (2006).
  7. Richter-Heitmann, T., Eickhorst, T., Knauth, S., Friedrich, M. W., Schmidt, H. Evaluation of Strategies to Separate Root-Associated Microbial Communities: A Crucial Choice in Rhizobiome Research. Front Microbiol. 7, 773 (2016).
  8. Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R., Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 5709, 623-628 (2011).
  9. Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
  10. Busby, P. E., et al. Research priorities for harnessing plant microbiomes in sustainable agriculture. PLoS Biol. 15 (3), e2001793 (2017).
  11. Thompson, L. R., et al. A communal catalogue reveals Earth’s multiscale microbial diversity. Nature. , (2017).
  12. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6 (8), 1621-1624 (2012).
  13. Kozich, J. J., Westcott, S. L., Baxter, N. T., Highlander, S. K., Schloss, P. D. Development of a Dual-Index Sequencing Strategy and Curation Pipeline for Analyzing Amplicon Sequence Data on the MiSeq Illumina Sequencing Platform. Appl Environ Microb. 79 (17), 5112-5120 (2013).
  14. Degnan, P. H., Ochman, H. Illumina-based analysis of microbial community diversity. ISME J. 6 (1), 183-194 (2012).
  15. Naylor, D., DeGraaf, S., Purdom, E., Coleman-Derr, D. Drought and host selection influence bacterial community dynamics in the grass root microbiome. ISME J. , (2017).
  16. Desgarennes, D., Garrido, E., Torres-Gomez, M. J., Peña-Cabriales, J. J., Partida-Martinez, L. P. Diazotrophic potential among bacterial communities associated with wild and cultivated Agave species. FEMS Microbiol Ecol. 90 (3), 844-857 (2014).
  17. Coleman-Derr, D., et al. Plant compartment and biogeography affect microbiome composition in cultivated and native Agave species. New Phytol. 209 (2), 798-811 (2016).
  18. De Tender, C., et al. Dynamics in the Strawberry Rhizosphere Microbiome in Response to Biochar and Botrytis cinerea Leaf Infection. Front Microbiol. 7, 2062 (2016).
  19. Kapp, J. R., et al. Variation in pre-PCR processing of FFPE samples leads to discrepancies in BRAF and EGFR mutation detection: a diagnostic RING trial. J Clin Pathol. 68 (2), 111-118 (2015).
  20. Simbolo, M., et al. DNA qualification workflow for next generation sequencing of histopathological samples. PLoS One. 8 (6), e62692 (2013).
  21. O’Neill, M., McPartlin, J., Arthure, K., Riedel, S., McMillan, N. Comparison of the TLDA with the Nanodrop and the reference Qubit system. J Phys Conf Ser. 307 (1), 012047 (2011).
  22. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Rosen, M. J., Han, A. W., Johnson, A. J. A., Holmes, S. P. DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data. Nat Methods. 13 (7), 581-583 (2016).
  23. Amir, A., et al. Deblur Rapidly Resolves Single-Nucleotide Community Sequence Patterns. mSystems. 2 (2), e00191-e00116 (2017).
  24. Edgar, R. C. UNOISE2: improved error-correction for Illumina 16S and ITS amplicon sequencing. bioRxiv. , 081257 (2016).
  25. Nguyen, N. -. P., Warnow, T., Pop, M., White, B. A perspective on 16S rRNA operational taxonomic unit clustering using sequence similarity. NPJ Biofilms Microbiomes. 2, 16004 (2016).
  26. Callahan, B. J., McMurdie, P. J., Holmes, S. P. Exact sequence variants should replace operational taxonomic units in marker-gene data analysis. ISME J. , (2017).
  27. Lundberg, D. S., Yourstone, S., Mieczkowski, P., Jones, C. D., Dangl, J. L. Practical innovations for high-throughput amplicon sequencing. Nat Methods. 10 (10), 999-1002 (2013).
  28. O’Brien, S. L., et al. Spatial scale drives patterns in soil bacterial diversity. Environ Microbiol. 18 (6), 2039-2051 (2016).
  29. Fierer, N., Lennon, J. T. The generation and maintenance of diversity in microbial communities. Am J Bot. 98 (3), 439-448 (2011).
  30. Fierer, N. Embracing the unknown: disentangling the complexities of the soil microbiome. Nat Rev Microbiol. 15 (10), 579-590 (2017).
  31. Buckley, D. H., Schmidt, T. M. Diversity and dynamics of microbial communities in soils from agro-ecosystems. Environ Microbiol. 5 (6), 441-452 (2003).
  32. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biol. 12, 87 (2014).
  33. Weiss, S., Amir, A., Hyde, E. R., Metcalf, J. L., Song, S. J., Knight, R. Tracking down the sources of experimental contamination in microbiome studies. Genome Biol. 15 (12), 564 (2014).
  34. Sutlović, D., Definis Gojanović, M., Andelinović, S., Gugić, D., Primorac, D. Taq polymerase reverses inhibition of quantitative real time polymerase chain reaction by humic acid. Croat Med J. 46 (4), 556-562 (2005).
  35. Sutlovic, D., Gamulin, S., Definis-Gojanovic, M., Gugic, D., Andjelinovic, S. Interaction of humic acids with human DNA: proposed mechanisms and kinetics. Electrophoresis. 29 (7), 1467-1472 (2008).
  36. Aleklett, K., Leff, J. W., Fierer, N., Hart, M. Wild plant species growing closely connected in a subalpine meadow host distinct root-associated bacterial communities. PeerJ. 3, e804 (2015).
  37. Bogas, A. C., et al. Endophytic bacterial diversity in the phyllosphere of Amazon Paullinia cupana associated with asymptomatic and symptomatic anthracnose. Springerplus. 4, 258 (2015).
  38. Hiscox, J., Savoury, M., Müller, C. T., Lindahl, B. D., Rogers, H. J., Boddy, L. Priority effects during fungal community establishment in beech wood. ISME J. 9 (10), 2246-2260 (2015).
  39. Zhang, T., Yao, Y. -. F. Endophytic Fungal Communities Associated with Vascular Plants in the High Arctic Zone Are Highly Diverse and Host-Plant Specific. PLoS One. 10 (6), e0130051 (2015).
  40. Ghyselinck, J., Pfeiffer, S., Heylen, K., Sessitsch, A., De Vos, P. The effect of primer choice and short read sequences on the outcome of 16S rRNA gene based diversity studies. PLoS One. 8 (8), e71360 (2013).
  41. Wintzingerode, F., Landt, O., Ehrlich, A., Göbel, U. B. Peptide nucleic acid-mediated PCR clamping as a useful supplement in the determination of microbial diversity. Appl Environ Microb. 66 (2), 549-557 (2000).
  42. Cruaud, P., Vigneron, A., Lucchetti-Miganeh, C., Ciron, P. E., Godfroy, A., Cambon-Bonavita, M. -. A. Influence of DNA extraction method, 16S rRNA targeted hypervariable regions, and sample origin on microbial diversity detected by 454 pyrosequencing in marine chemosynthetic ecosystems. Appl Environ Microb. 80 (15), 4626-4639 (2014).
  43. Yang, B., Wang, Y., Qian, P. -. Y. Sensitivity and correlation of hypervariable regions in 16S rRNA genes in phylogenetic analysis. BMC Bioinformatics. 17, 135 (2016).
check_url/pt/57561?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Simmons, T., Caddell, D. F., Deng, S., Coleman-Derr, D. Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere. J. Vis. Exp. (135), e57561, doi:10.3791/57561 (2018).

View Video