מודל דוקסורוביצין-induced קרדיומיופתיה בדג זברה למבוגרים
Summary
שיטה לייצר מודל קרדיומיופתיה דוקסורוביצין-induced למבוגרים דג זברה (רזבורה rerio) מתואר כאן. שתי דרכים חלופיות של הזרקת בקרום הבטן מוצגים ואת התנאים כדי להפחית וריאציות בין קבוצות שונות ניסיוני הנדונים.
Abstract
דג זברה בוגרת גנטית נגיש (רזבורה rerio) יותר ויותר שימש כמודל חוליות להבנת מחלות אנושיות כגון שריר הלב. בשל הנוחות amenability כדי מניפולציות גנטיות תפוקה גבוהה, הדור של קרדיומיופתיה רכשה מודלים, כגון המודל דוקסורוביצין-induced קרדיומיופתיה (DIC) בדג זברה למבוגרים, פותח את דלתות השדרות מחקר חדש, לרבות גילוי סימני פיסוק שריר הלב באמצעות בדיקה גנטית קדימה. שונה מהמודל DIC דג זברה עובריים, חריפה הראשונית והן לאחר מכן כרונית השלבים של שריר הלב יכול להיקבע במודל DIC דג זברה למבוגרים, המאפשרת לימוד מנגנוני איתות תלויי-הבמה אסטרטגיות טיפוליות. עם זאת, ניתן להשיג תוצאות משתנה עם המודל הנוכחי, אפילו בידי חוקרים מנוסים. כדי להקל על יישום העתידי של המודל DIC, אנו מציגים פרוטוקול מפורט כיצד ליצור מודל זה DIC בדג זברה בוגרת. ומתארות שתי דרכים חלופיות בקרום הבטן הזרקה (IP). בהמשך נדון אפשרויות כיצד להפחית וריאציות כדי להשיג תוצאות אמינות ואת לספק הצעות כיצד לפרש את התוצאות בהתאם.
Introduction
דוקסורוביצין (DOX), גם בשם Adriamycin, פותחה כמו תרופה אנטי-אמצעים מאז שנות ה-601,2. עכשיו זה עדיין בשימוש פעיל בשם כימותרפית חשוב עבור קשת רחבה של גידולים. עם זאת, יישום קליני של DOX היה הקשו על ידי שלה רעילות למינון, במיוחד cardiotoxicity מאופיין על ידי הסימפטומים משתנים החל שינויים electrocardiographic ללא תסמינים דלקת כרום הלב ולא מפוצה קרדיומיופתיה 1 , 2. עד כה, הועלו השערות הגדולות לפחות שלושה להסביר DIC, כולל חמצן תגובתי מופעל מינים (ROS)1,3,4,5, עיכוב של טופואיזומראז II-β ( 6,TOP2β)7, ו אפנון של סידן תאיים שחרור1,8,9. לצבירת ראיות גם מרמזת על נטייה גנטית מהווה גורם סיכון מרכזי DIC10,11,12,13. זהויות גנים הקשורים נטיות אלה DIC, לעומת זאת, נותרים אינו מודע לקיומם. Dexrazoxane הוא היחיד אדג’וונט סוכן שאושרו על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) לטיפול DIC, אבל עם יישום מוגבל14,15,16, דבר המלמד את הצורך לזהות נוספים אסטרטגיות טיפוליות. מודלים חייתיים של DIC נידונות ולכן למטרות אלו. בשל הנגישות שלהם ואת הפשטות, מחקרים מכניסטית בדגמים DIC יכול באופן פוטנציאלי יש רחבה יותר השפעות על סוגים אחרים של cardiomyopathies: פתוגנזה נפוצה עשוי להיות משותף בין cardiomyopathies של חבלות מסיבות שונות, במיוחד בזמן מאוחר יותר שלבים פתולוגיים17,18,19,20.
בנוסף מודלים מכרסם של DIC, פותחו מודלים DIC דג זברה עם תפוקה גבוהה יותר כדי להקל על הגילוי של גורמים גנטיים חדשים והן הרפוי. מודל DIC עובריים הוקם העוברים דג זברה שקוף לסינון תרכובות טיפולית21. בהתחשב בכך cardiomyopathies הן מחלות תחילת למבוגרים עם הפתוגנזה פרוגרסיב, קרדיומיופתיה דג זברה בוגרת מודלים כבר פיתח22,23,24,25,26. אנחנו שנוצר המודל רכשה הראשון הנובע אנמיה כרונית24, ואחריו DIC כמודל קרדיומיופתיה רכשה השני דג זברה בוגרת23של שריר הלב. מצאנו כי הזרקה של סיילין יחיד DOX לתוך דג זברה בוגרת המניע cardiotoxicity המורכב שלב אקוטי בערך בתוך 1 בשבוע שלאחר ההזרקה (wpi), בעקבות שלב כרונית של שריר הלב עד 6 חודשים לאחר ההזרקה. בעוד haploinsufficiency של מטרת rapamycin מכניסטית(mtor) המשפרת את שריר הלב בשלב כרוני, היא מגזימה תמותת דגים בשלב אקוטי, דבר המלמד את הערך של המודל DIC למבוגרים להבחין תלויי-שלב מנגנונים23. אנחנו עוד יותר הוכיח כי המודל DIC למבוגרים יכול לשמש כדי להדגיש אוסף של דג זברה insertional לב (ZIC) המוטנטים שנוצרו באמצעות גישה המבוסס על transposon מוטגנזה מכוונת insertional27. מסך פיילוט זיהה 3 גנים ידועים של שריר הלב, כמו גם DnaJ (Hsp40) homolog, תת משפחה B וחבר 6b (dnajb6b) כמו חדש DIC הרגישות גנים28. לכן, הדור של המודל DIC למבוגרים בדג זברה הוביל מתודולוגיה חדשה המאפשרת זיהוי ממגבילי גנטיים עבור DIC, אשר משלים את הגנום כולו האגודה קיים מחקר (GWAS) ואת לוקוס תכונה כמותית (QTL באופן שיטתי ) ניתוח.
בתקופת הדור, יישומו של המודל DIC דג זברה למבוגרים, הבחנו וריאציות משמעותית בקרב חוקרים שונים ו/או אפילו בין זריקות שונות שביצע החוקר אותו. הטבע האורך של המודל מטיל אתגרים רישום תוצאות של חוקרים שונים, את תהליך פתרון הבעיות רציפים. כדי להקל על השימוש פשוט בתדר קרדיומיופתיה מתח שיטה זו על ידי קהילת המחקר, אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו בפירוט, נוכח שני סוגים של הזרקת ה-IP, ולדון שיקולים להפחית וריאציות בקרב חוקרים שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
המודל של DIC מתקדמת, המינון של 20 מ”ג/ק”ג DOX נקבע ניסיוניים בתור המינון הגבוה גורם המוות דגים משמעותית במהלך 1 wpi אבל עדיין תוצאות במוות דגים וצמצום של תפקוד הלב לאחר wpi 4 (איור 3 ו איור 4C). מנה זו משולה אלה המשמשות לעתים קרובות במודלים DIC מכרסמים (15-25 מ”ג/ק”ג), המינון ה…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקו על ידי מענק פיתוח מדען של איגוד הלב האמריקני (14SDG18160021 כדי הסתייגות), R01 NIH ארה ב מעניקה HL 81753 HL 107304 ל XX ואת לקרן מאיו XX.
Materials
| Crossing tank | Aquaneering | ZHCT100 | Fish breeding |
| Incubator | ThermoFisher | Maintaining embryo | |
| 3 L medium tank | Aquaneering | ZT280 | Maintaining fish |
| Paramecia | Carolina | 131560 | Food for juvenile fish |
| Live hatched brine shrimp | in house | Food for adult fish | |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma | D1515-10MG | |
| 1.5 ml safe-lock tube | Eppendorf | No. 022363204 | For drug storage |
| Aluminum foil paper | Fisher | 1213104 | For preventing light exposure |
| Proteinase K | Roche | No. 03115887001 | For dechorionating embryo |
| Hank's balanced salt solution (HBBS) | ThermoFisher | 14025076 | Vehicle for DOX |
| 100 mm petri dish | Falcon | 431741 | |
| 10 μL NanoFil micro-syringe | WPI | NANOFIL | For injection |
| 34 gauge needle | WPI | NF34BV-2 | For injection |
| Tricaine | Argent | MS-222 | Anesthetizing fish |
| 96 well plate | Costar | 3539 | For embryo drug treatment |
| Transfer pipette | Bel-art product | F37898 | For transfering embryo |
Referências
- Octavia, Y., et al. Doxorubicin-induced cardiomyopathy: from molecular mechanisms to therapeutic strategies. J Mol Cell Cardiol. 52 (6), 1213-1225 (2012).
- Singal, P. K., Iliskovic, N. Doxorubicin-induced cardiomyopathy. N Engl J Med. 339 (13), 900-905 (1998).
- Angsutararux, P., Luanpitpong, S., Issaragrisil, S. Chemotherapy-Induced Cardiotoxicity: Overview of the Roles of Oxidative Stress. Oxid Med Cell Longev. , 795602 (2015).
- Ichikawa, Y., et al. Cardiotoxicity of doxorubicin is mediated through mitochondrial iron accumulation. J Clin Invest. 124 (2), 617-630 (2014).
- Zhang, Y. W., Shi, J., Li, Y. J., Wei, L. Cardiomyocyte death in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 57 (6), 435-445 (2009).
- Sawyer, D. B. Anthracyclines and heart failure. N Engl J Med. 368 (12), 1154-1156 (2013).
- Zhang, S., et al. Identification of the molecular basis of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nat Med. 18 (11), 1639-1642 (2012).
- Dodd, D. A., et al. Doxorubicin cardiomyopathy is associated with a decrease in calcium release channel of the sarcoplasmic reticulum in a chronic rabbit model. J Clin Invest. 91 (4), 1697-1705 (1993).
- Mitry, M. A., Edwards, J. G. Doxorubicin induced heart failure: Phenotype and molecular mechanisms. Int J Cardiol Heart Vasc. 10, 17-24 (2016).
- Aminkeng, F., et al. A coding variant in RARG confers susceptibility to anthracycline-induced cardiotoxicity in childhood cancer. Nat Genet. 47 (9), 1079-1084 (2015).
- Deng, S., et al. Dystrophin-deficiency increases the susceptibility to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Eur J Heart Fail. 9 (10), 986-994 (2007).
- Leong, S. L., Chaiyakunapruk, N., Lee, S. W. Candidate Gene Association Studies of Anthracycline-induced Cardiotoxicity: A Systematic Review and Meta-analysis. Sci Rep. 7 (1), 39 (2017).
- Wasielewski, M., et al. Potential genetic predisposition for anthracycline-associated cardiomyopathy in families with dilated cardiomyopathy. Open Heart. 1 (1), e000116 (2014).
- Lebrecht, D., et al. Dexrazoxane prevents doxorubicin-induced long-term cardiotoxicity and protects myocardial mitochondria from genetic and functional lesions in rats. Br J Pharmacol. 151 (6), 771-778 (2007).
- QuanJun, Y., et al. Protective Effects of Dexrazoxane against Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity: A Metabolomic Study. PLoS One. 12 (1), e0169567 (2017).
- Seifert, C. F., Nesser, M. E., Thompson, D. F. Dexrazoxane in the prevention of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Ann Pharmacother. 28 (9), 1063-1072 (1994).
- Adams, J. W., et al. Enhanced Galphaq signaling: a common pathway mediates cardiac hypertrophy and apoptotic heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 10140-10145 (1998).
- Bowles, N. E., Bowles, K. R., Towbin, J. A. The "final common pathway" hypothesis and inherited cardiovascular disease. The role of cytoskeletal proteins in dilated cardiomyopathy. Herz. 25 (3), 168-175 (2000).
- Kroumpouzou, E., et al. Common pathways for primary hypertrophic and dilated cardiomyopathy. Hybrid Hybridomics. 22 (1), 41-45 (2003).
- Towbin, J. A., Bowles, K. R., Bowles, N. E. Etiologies of cardiomyopathy and heart failure. Nat Med. 5 (3), 266-267 (1999).
- Liu, Y., et al. Visnagin protects against doxorubicin-induced cardiomyopathy through modulation of mitochondrial malate dehydrogenase. Sci Transl Med. 6 (266), 266ra170 (2014).
- Asimaki, A., et al. Identification of a new modulator of the intercalated disc in a zebrafish model of arrhythmogenic cardiomyopathy. Sci Transl Med. 6 (240), 240ra274 (2014).
- Ding, Y., et al. Haploinsufficiency of target of rapamycin attenuates cardiomyopathies in adult zebrafish. Circ Res. 109 (6), 658-669 (2011).
- Sun, X., et al. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4 (8), e6596 (2009).
- Sun, Y., et al. Activation of the Nkx2.5-Calr-p53 signaling pathway by hyperglycemia induces cardiac remodeling and dysfunction in adult zebrafish. Dis Model Mech. 10 (10), 1217-1227 (2017).
- Yang, J., Shah, S., Olson, T. M., Xu, X. Modeling GATAD1-Associated Dilated Cardiomyopathy in Adult Zebrafish. J Cardiovasc Dev Dis. 3 (1), (2016).
- Ding, Y., et al. Trapping cardiac recessive mutants via expression-based insertional mutagenesis screening. Circ Res. 112 (4), 606-617 (2013).
- Ding, Y., et al. A modifier screen identifies DNAJB6 as a cardiomyopathy susceptibility gene. JCI Insight. 2 (8), (2017).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal injection into adult zebrafish. J Vis Exp. (42), (2010).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Dis Model Mech. 10 (1), 63-76 (2017).
- Desai, V. G., et al. Development of doxorubicin-induced chronic cardiotoxicity in the B6C3F1 mouse model. Toxicol Appl Pharmacol. 266 (1), 109-121 (2013).
- Zhu, W., Shou, W., Payne, R. M., Caldwell, R., Field, L. J. A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction. Pediatr Res. 64 (5), 488-494 (2008).
- Chatterjee, K., Zhang, J., Honbo, N., Karliner, J. S. Doxorubicin cardiomyopathy. Cardiology. 115 (2), 155-162 (2010).
- Bang, C., et al. Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate cardiomyocyte hypertrophy. J Clin Invest. 124 (5), 2136-2146 (2014).
- Rassaf, T., Kelm, M. Protection from diabetic cardiomyopathy – putative role of the retinoid receptor-mediated signaling. J Mol Cell Cardiol. 59, 179-180 (2013).
- Wahbi, K., et al. Dilated cardiomyopathy in patients with mutations in anoctamin 5. Int J Cardiol. 168 (1), 76-79 (2013).
- Zhou, M. D., Sucov, H. M., Evans, R. M., Chien, K. R. Retinoid-dependent pathways suppress myocardial cell hypertrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7391-7395 (1995).
- Hershman, D. L., et al. Doxorubicin, cardiac risk factors, and cardiac toxicity in elderly patients with diffuse B-cell non-Hodgkin’s lymphoma. J Clin Oncol. 26 (19), 3159-3165 (2008).
- Silber, J. H., Barber, G. Doxorubicin-induced cardiotoxicity. N Engl J Med. 333 (20), 1359-1360 (1995).
- Von Hoff, D. D., et al. Risk factors for doxorubicin-induced congestive heart failure. Ann Intern Med. 91 (5), 710-717 (1979).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. (34), (2009).
- Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel protocol for the oral administration of test chemicals to adult zebrafish. Zebrafish. 8 (4), 203-210 (2011).
- Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging adult zebrafish. J Vis Exp. (78), (2013).
