عزل العقد الجذرية الظهرية والثقافة الأولية لدراسة الإفراج عن ناقل عصبي
Summary
كثيرا ما تستخدم الجذر الظهرية ganglia (DRG) الثقافات الأولية لدراسة الوظائف الفسيولوجية أو الأحداث المتعلقة بعلم الأمراض في الخلايا العصبية الحسية. هنا، نحن شرح استخدام الثقافات DRG القطني للكشف عن الإفراج عن العصبية بعد مستقبلات neuropeptide فرنك فرنسي اكتب التحفيز 2 مع مؤثر انتقائية.
Abstract
العقد الجذرية الظهرية (DRG) تحتوي على جثث الخلية من الخلايا العصبية الحسية. هذا النوع من الخلايا العصبية شبه أحادي القطب، مع اثنين من محاور عصبية التي يعصب الأنسجة المحيطية، مثل الجلد، والعضلات وأجهزة الحشوي، فضلا عن القرن الأفريقي الظهرية العمود الفقري للجهاز العصبي المركزي. الخلايا العصبية الحسية يحيل الإحساس الجسدية، بما في ذلك اللمس، الألم، والأحاسيس الحرارية، والتحفيز. ولذلك، تستخدم على نطاق واسع الثقافات الرسم الأساسي لدراسة آليات nociception الخلوية، والوظائف الفسيولوجية للخلايا العصبية الحسية والعصبية التنمية. ويمكن تطبيق الخلايا العصبية مثقف في الدراسات التي تنطوي على الكهربية وتوصيل الإشارة والإفراج عن ناقل عصبي، أو تصوير الكالسيوم. مع الثقافات الرسم الأساسي، والعلماء قد الثقافة الخلايا العصبية DRG منفصلان لرصد التغيرات البيوكيميائية في واحد أو عدة خلايا، التغلب على العديد من أوجه القصور المرتبطة بالتجارب في فيفو . مقارنة تجارياً المتاحة خطوط خلايا هيبريدوما DRG أو مخلدة الرسم خطوط الخلايا العصبية وتكوين وخصائص الخلايا الأولية أكثر بكثير مماثلة للخلايا العصبية الحسية في الأنسجة. ومع ذلك، نظراً للعدد المحدود من الرسم مثقف الابتدائية الخلايا التي يمكن أن تكون معزولة عن حيوان مفردة، من الصعب أداء شاشات الفائق للمخدرات تستهدف الدراسات. ويرد في المادة الحالية، إجراءات تحصيل الرسم والثقافة. وبالإضافة إلى ذلك، علينا أن نظهر معاملة مثقف DRG الخلايا مع مؤثر مستقبلات neuropeptide فرنك فرنسي نوع 2 (NPFFR2) للحث على الإفراج عن العصبية الببتيد (كالسيتونين المتصلة بالجينات الببتيد (كرجب) ومادة ف (س)).
Introduction
الهيئات الخلية من الخلايا العصبية الحسية الواردة ضمن الرسم. هذه الخلايا العصبية الزائفة أحادي القطب ويعصب الأنسجة المحيطية والجهاز العصبي المركزي. تم العثور على النهايات الطرفية العصبية من الخلايا العصبية الحسية في الجلد وأجهزة الحشوي، العضلات والعظام، وبين سائر الأنسجة. هي إرسال إشارات الإحساس الطرفية للعصب النهايات في القرن الأفريقي الظهرية العمود الفقري والإشارات ثم تنتقل إلى الدماغ عبر مسارات مختلفة تصاعدي من الإحساس جسمية1،2. ويتيح الإحساس جسدية الجسم ليشعر (أي، تعمل باللمس والألم والأحاسيس الحرارية) وتصور الحركة والتوجه المكاني (التحفيز الأحاسيس)1،3. وهناك أربع فئات فرعية من محاور عصبية الزبائ الأولية، بما في ذلك المجموعة الأولى من الألياف (Aα) التي تستجيب لوضع الجسم عضلات الهيكل العظمى، والفريق الثاني (Aβ) الألياف التي تستجيب ميتشانوريسيبتورس الجلد، والمجموعة الثالثة (Aδ) ومجموعة ألياف الخامس (ج) الاستجابة للألم و درجة الحرارة. فقط الألياف ج أونميليناتيد، في حين بقية myelinated بدرجات مختلفة.
نوسيسيبتورس هي الخلايا العصبية الحسية الأولية، التي يتم تنشيطها بالمنبهات الضارة (تحفيز الميكانيكية والحرارية والكيميائية) التي تحمل إمكانات لتلف الأنسجة. وتتكون هذه الخلايا العصبية ميليناتيد Aδ الألياف والألياف ج أونميليناتيد1،4. ألياف Aδ التعبير عن مستقبلات عامل نمو العصب (ستموت، مستقبلات ترقا) وكجرب sp. وتصنف الألياف ج ألياف ج أما من بيبتيديرجيك وغير بيبتيديرجيك. من ناحية أخرى، أعرب الألياف ج غير بيبتيديرجيك المستقبلات لعامل نيوروتروفيك الدبقية مشتقة (مستقبلات جدنف، والمقصود بالصندوق، و GFR)، إيسوليكتين IB4، وبوابات ATP أيون قناة النوع الفرعي (P2X3)5،،من67. يمكن أن تتميز بالتعبير عن قنوات أيون nociceptors وتفعيلها من خلال العوامل نيوروتروفيك، السيتوكينات، neuropeptides، ATP، أو المواد الكيميائية الأخرى مركبات8. يج وز على التحفيز، والعصبية، بما في ذلك كجرب و SP غلوتامات من المحطات العصبية الحسية في القرن الأفريقي الظهرية العمود الفقري إرسال إشارات nociceptive2. الرسم ليست فقط تتكون من الخلايا العصبية، ولكن أيضا تحتوي على الخلايا الدبقية الأقمار الصناعية. تحيط الخلايا العصبية الحسية الخلايا الأقمار الصناعية وتقديم الدعم الميكانيكية والايض9،10. من المثير للاهتمام، وهناك مجموعة متزايدة من الأدلة تشير إلى أن الخلايا الدبقية الساتلية في الرسم قد يكون متورطا في تنظيم ألم الإحساس11.
الخلايا العصبية الحسية أفيد أن يكون الأكثر كثيرا ما تستخدم الخلايا العصبية الأولية12 وقد استخدمت لتوصيل الإشارة الكهربية والعصبي الإفراج عن الدراسات. أنها تستخدم عادة لاستكشاف الآليات الخلوية لتنمية الخلايا العصبية والألم التهابات والأم الأعصاب، والإحساس بالجلد (مثل حكة) واكسون ثمرة12،13،،من1415. يمكن مثقف الرسم الأساسي الثقافات كالخلايا العصبية معزولة تقييم التغيرات البيوكيميائية في واحدة أو في خلايا متعددة، السماح للعلماء إجراء الدراسات التي يتعذر إجراؤها في المواضيع التجريبية. في الآونة الأخيرة، تم بنجاح مثقف الرسم من الجهات المانحة الجهاز البشري الذي قد تستفيد كثيرا من البحوث متعدية16. من ناحية أخرى، يمكن أيضا استزراع الخلايا العصبية الحسية كما DRG explants. DRG explants الحفاظ على بنية الأنسجة الأصلية من الخلايا العصبية، بما في ذلك خلايا شوان والأقمار الصناعية الخلايا الدبقية، وهي مفيدة بشكل خاص لدراسة التفاعلات بين الخلايا العصبية وغير العصبية17. يمكن بسهولة إعداد الرسم الأساسي الثقافات داخل ح 2.5. تكوين الخلية وخصائص عاكسة لمصدر الرسم، وعلى هذا النحو، يمكن جمعها بالرسم المحددة (DRG القطني أو الصدري) وفقا لمطالب التجريبية. الثقافات من الأجنة وحديثي الولادة DRG الخلايا العصبية تتطلب ستموت البقاء على قيد الحياة، والحث على ثمرة محور عصبي، ولكن الثقافات من الخلايا العصبية الكبار لا تتطلب إضافة العوامل نيوروتروفيك لل12،وسائل الإعلام17. وهناك أيضا خطوط خلايا هيبريدوما DRG المتاحة تجارياً مثل ND7/23 و F11، التي لا تتطلب استخدام الحيوانات التجريبية. ومع ذلك، عدم الموجبة المحتملة مستقبلات عابرة قناة الأعضاء الفصيلية V 1 (TRPV1) التعبير (علامة هامة للخلايا العصبية nociceptive الحسية الصغيرة) وملامح التعبير الجيني تتعارض تحد من تلك التطبيقات18. في الآونة الأخيرة، مخلدة الخلايا العصبية الرسم خطوط مستمدة من الفئران (50B11)19 و20من الماوس (MED17.11)، التي مناسبة لاستخدام في شاشات الفائق للمخدرات تستهدف الدراسات. بيد أن التعبير الجيني التنميط لخطوط الخلية هذه لم تتم. وهكذا، التحقق من صحة التجارب المقارنة بين هذه الخلايا مخلدة للخلايا العصبية الحسية لا تزال جارية.
NPFFR2 هو توليفها في الرسم وذوبانها للمحطات الطرفية العصبية الحسية في العمود الفقري الظهرية القرن21. في هذه المقالة، نحن نقدم بروتوكولا لاستزراع خلايا DRG القطنية والتعامل معهم بمؤثر NPFFR2 للحث على الإفراج عن العصبية، كجرب و sp. الاعتماد على NPFFR2 هو اختبار المزيد من استخدام NPFFR2 صغيرة تدخل الجيش الملكي النيبالي (siRNA)، التي قد ترانسفيكتيد في الخلايا المستزرعة DRG.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المادة، نبدي جمع وإنزيم-الانفصال، وثقافة الفئران القطني DRG. مع دعم نيوروتروفيك من ستموت، مد محاور عصبية من الخلايا العصبية الرسم في غضون 3 أيام بعد البذر الخلية. محاور عصبية طويلة كانت واضحة يمكن ملاحظتها بعد الخلايا كانت الملون لبروتين CGRP، التي يتم توليفها في سوما الخلية ونقلها على…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الدكتور م. Calkins لتحرير اللغة الإنجليزية. وكان يؤيد هذا العمل تشانغ Gung التذكاري مستشفى (CMRPD1F0482) وجامعة الأمنيون تشانغ، ومركز بحوث الشيخوخة الصحية (EMRPD1G0171) ووزارة العلوم والتكنولوجيا (105-2320-B-182-012-MY2).
Materials
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
Referências
- Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. . Neuroscience: exploring the brain. , (2007).
- Hunt, S. P., Mantyh, P. W. The molecular dynamics of pain control. Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. . Principles of neural science. , (2000).
- Julius, D., Basbaum, A. I. Molecular mechanisms of nociception. Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).
- Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain. Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).
- Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms. Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
- Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. Role of the immune system in chronic pain. Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).
- Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat. Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).
- Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study. J Neuroinflammation. 8, 126 (2011).
- Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain. Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).
- Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. The peripheral and central mechanisms underlying itch. BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).
- Valtcheva, M. V., et al. Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures. Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).
- Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).
- Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison. Mol Pain. 12, (2016).
- Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line. J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).
- Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors. PLoS One. 10 (6), e0128670 (2015).
- Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn. Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).
- Lin, Y. T., et al. Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice. Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).
- Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia. Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).
- Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain. Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).
