Isolement des ganglions de la racine dorsale et la Culture primaire afin d’étudier la libération des neurotransmetteurs
Summary
Les cultures primaires (DRG) les ganglions de la racine dorsale sont fréquemment utilisés pour étudier les fonctions physiologiques ou pathologie imprévisibles dans les neurones sensoriels. Ici, nous montrent l’utilisation de cultures DRG lombaires pour détecter la libération de neurotransmetteurs après le type de récepteur de neuropeptide FF 2 stimulation avec un agoniste sélectif.
Abstract
Les ganglions rachidiens (DRG) contiennent les corps cellulaires des neurones sensoriels. Ce type de neurone est Pseudo-aléatoire unipolaire, avec deux axones qui innervent les tissus périphériques, tels que peau, muscles et organes viscéraux, ainsi que la corne dorsale de la colonne vertébrale du système nerveux central. Les neurones sensoriels transmettent la sensibilité somatique, y compris le touch, des douleurs, des sensations thermiques et proprioceptives. Par conséquent, les cultures primaires de DRG sont largement utilisés pour étudier les mécanismes cellulaires de la nociception, fonctions physiologiques des neurones sensoriels et développement neural. Les neurones en culture peuvent être appliquées dans les études impliquant l’électrophysiologie, transduction du signal, la libération des neurotransmetteurs ou imagerie calcique. Avec des cultures primaires de DRG, scientifiques peuvent culture dissociés DRG neurones pour surveiller les modifications biochimiques en seul ou plusieurs cellules, surmonter beaucoup des restrictions associées à des expériences in vivo . Par rapport à commercialement disponible DRG-hybridome lignées cellulaires ou immortalisé des lignées de cellules neuronales DRG, la composition et propriétés des cellules primaires sont beaucoup plus semblables à des neurones sensoriels dans les tissus. Toutefois, en raison du nombre limité de cellules cultivées de primaire DRG qui peuvent être isolés dans un seul animal, il est difficile d’effectuer des écrans de haut-débit pour médicament ciblant les études. Dans l’article actuel, procédures pour collection DRG et la culture sont décrites. En outre, nous montrons le traitement des cellules cultivées de DRG avec un agoniste du type de récepteur neuropeptide FF 2 (NPFFR2) pour induire la libération de neurotransmetteurs peptidiques (peptide lié au gène de la calcitonine (CRGP) et la substance P (SP)).
Introduction
Les corps cellulaires des neurones sensitifs sont contenues au sein de la DRG. Ces neurones sont Pseudo-aléatoire unipolaires et innervent les tissus périphériques et le système nerveux central. Les terminaisons nerveuses périphériques de neurones sensoriels sont trouvent dans le muscle, peau, organes viscéraux et OS, entre autres tissus. Ils transmettent les signaux de sensation périphériques au nerf terminaisons dans la corne dorsale de la colonne vertébrale et les signaux sont ensuite transmis au cerveau par différentes voies ascendantes de la sensibilité somatique1,2. La sensibilité somatique permet au corps de se sentir (c’est-à-dire, touch, la douleur et les sensations thermiques) et de percevoir le mouvement et l’orientation spatiale (les sensations proprioceptives)1,3. Il y a quatre sous-classes de primaires axones afférents, y compris groupe I fibres (Aα) qui répondent à la proprioception des muscles squelettiques, les fibres II (Aβ) groupe répondant aux mécanorécepteurs de la peau, et le groupe III (Aδ) et fibres de V (C) groupe qui réagissent à la douleur et température. Seulement les fibres C sont amyélinisés, tandis que le reste sont myélinisées à différents degrés.
Nocicepteurs sont des neurones sensitifs primaires, qui sont activés par des stimuli nociceptifs (stimulation mécanique, thermique et chimique) qui portent le risque de lésions tissulaires. Ces neurones sont composées de fibres Aδ myélinisées et amyélinisés C fibres1,4. Les fibres Aδ expriment les récepteurs du facteur de croissance de nerf (NGF, récepteur trkA), CGRP et SP. Les fibres C sont classés comme des fibres C soit peptidergiques et non-peptidergiques. En revanche, les fibres C non-peptidergiques expriment les récepteurs du facteur neurotrophique dérivé du glial (récepteurs GDNF, RET et GFR), isolectine IB4 et ATP-gated ion channel sous-type (P2X3)5,6,7. Nocicepteurs peuvent être distinguées par l’expression des canaux ioniques et activées par facteurs neurotrophiques, cytokines, neuropeptides, ATP ou autres produits chimiques composés de8. Lors de la stimulation, neurotransmetteurs, y compris le CGRP, SP et glutamate peuvent être libérés des terminaisons de neurone sensitif dans la corne dorsale spinale pour transmettre des signaux nociceptifs2. DRG ne sont pas seulement composé de neurones, mais contiennent également des cellules gliales par satellite. Cellules satellites entourent les neurones sensoriels et fournir un appui mécanique et métabolique9,10. Fait intéressant, il y a un nombre croissant de preuves indiquant que les cellules gliales par satellite dans le PMSI pourraient être impliqués dans la régulation de la douleur sensation11.
Les neurones sensoriels ont été signalés le plus fréquemment utilisé des cellules neuronales primaires12 et ont été utilisé pour l’électrophysiologie, transduction du signal et des études de libération neurotransmetteur. Ils sont aussi couramment utilisés pour explorer les mécanismes cellulaires du développement neuronal, douleur inflammatoire, douleur neuropathique, sensation de peau (comme les démangeaisons) et axon excroissance12,13,14,15. Les cultures primaires de DRG peuvent être cultivées comme des neurones dissociés pour évaluer les changements biochimiques dans une ou plusieurs cellules, permettant aux scientifiques d’effectuer des études qui ne peuvent être effectuées chez des sujets expérimentaux. Récemment, DRG provenaient d’échantillons avec succès de donneurs d’organes humains qui pourraient grandement bénéficier de recherche translationnelle16. En revanche, les neurones sensoriels peuvent être aussi cultivées comme explants de DRG. Les explants DRG préserver l’architecture originale de tissu des neurones, y compris les cellules de Schwann et de cellules gliales par satellite et sont particulièrement utiles pour étudier les interactions entre cellules neuronales et non neuronales17. Les cultures primaires de DRG peuvent être facilement établis au sein de 2,5 h. Les propriétés et la composition cellulaire sont hautement réfléchissantes de la source de la DRG, et à ce titre, DRG spécifique (DRG lombaire ou thoracique) peut être collecté selon les demandes expérimentales. Les cultures de neurones DRG embryonnaires et néonatales nécessitent NGF à survivre et à induire l’excroissance des axones, mais les cultures de neurones adultes ne nécessitent pas l’ajout de facteurs neurotrophiques aux médias12,17. Il y a aussi des lignées de cellules DRG-hybridome disponibles dans le commerce comme ND7/23 et F11, qui ne nécessitent pas l’utilisation des animaux d’expérimentation. Toutefois, l’absence du cation potentiel récepteur transitoire canal membre du subfamily V 1 (TRPV1) expression (un marqueur important de petits neurones nociceptifs sensoriels) et les profils d’expression génique incongrues limitent leurs demandes18. Récemment, immortalisé les cellules neuronales de DRG lignes ont été dérivées du rat (50B11)19 et20de souris (MED17.11), qui conviennent à utilisent dans les écrans de haut-débit pour médicament ciblant les études. Toutefois, l’expression de gènes de ces lignées cellulaires n’a pas encore à accomplir. Ainsi, les expériences de validation en comparant ces cellules immortalisées à neurones sensoriels sont toujours en cours.
NPFFR2 est synthétisé dans le PMSI et transloqué aux bornes du nerf sensitif dans la corne dorsale de la moelle21. Dans cet article, nous fournissons un protocole pour la mise en culture des cellules GRD lombaires et traiter avec un agoniste de NPFFR2 pour provoquer la libération de neurotransmetteurs, CGRP et SP. La dépendance sur NPFFR2 est soumise à d’autres NPFFR2 petits ARN interférents (siARN), qui peut être transfecté dans des cellules cultivées de la DRG.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans le présent article, nous démontrons la collection, enzyme-dissociation et la culture des lombaires rat DRG. Avec le soutien de neurotrophique de NGF, les axones des neurones DRG étendu dans les 3 jours après l’ensemencement de la cellule. Les axones prolongées ont été clairement observables après que les cellules ont été colorés pour une protéine CGRP, qui est synthétisé dans le soma de la cellule et transporté le long des fibres de l’axone. Les procédés de cellules satellites aussi étendus, pe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr M. Calkins pour l’édition anglaise. Ce travail a été soutenu par le Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), l’Université Chang Gung, Healthy Aging Research Center (EMRPD1G0171) et ministère de la Science et technologie (105-2320-B-182-012-MY2).
Materials
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
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