Dorsal Root Ganglion isolasjon og primære kultur for å studere nevrotransmitter-løslate
Summary
Dorsal root Ganglion (DRG) primære kulturer brukes ofte til å studere fysiologiske funksjoner eller patologi-relaterte hendelser i sensoriske neurons. Her viser vi bruk av lumbale DRG kulturer å oppdage utgivelsen av nevrotransmittere etter neuropeptide FF reseptor type 2 stimulering med en selektiv Agonistiske.
Abstract
Dorsal root Ganglion (DRG) inneholder cellen legemer sensoriske neurons. Denne Nevron er pseudo Unipolare, med to axons som innervate perifere vev, for eksempel hud, muskler og visceral organer, samt spinal dorsal Hornet av det sentrale nervesystemet. Sensoriske neurons overføre somatiske følelsen, inkludert touch, smerte, temperatur og proprioceptive opplevelser. Derfor er DRG primære kulturer mye brukt til å studere cellulære mekanismer for nociception, fysiologiske funksjoner sensoriske neurons og neural utvikling. Kultivert neurons kan brukes i studier som involverer elektrofysiologi, signaltransduksjon, nevrotransmitter-løslate eller kalsium bildebehandling. Med DRG primære kulturer, forskere kan kultur dissosiert DRG neurons å overvåke biokjemiske endringer i én eller flere celler, overvinne mange av begrensningene knyttet i vivo eksperimenter. Sammenlignet kommersielt er tilgjengelig DRG-hybridoma linjer eller udødeliggjort DRG neuronal cellelinjer, komposisjon og egenskaper av primære cellene mye mer lik sensoriske neurons i vev. På grunn av begrenset antall kulturperler DRG primære celler som kan isoleres fra en enkelt dyr, er det imidlertid vanskelig å utføre høy gjennomstrømming skjermer for narkotika målretting studier. I gjeldende artikkel er prosedyrer for DRG samling og kultur beskrevet. I tillegg viser vi behandling av kultivert DRG celler med en Agonistiske neuropeptide FF reseptor type 2 (NPFFR2) å indusere utgivelsen av peptid nevrotransmittere (calcitonin gen-relaterte peptid (CRGP) og substans P (SP)).
Introduction
Cellen legemer sensoriske neurons er innenfor DRG. Disse neurons er pseudo Unipolare og innervate både perifere vev og sentralnervesystemet. De eksterne nerveender sensoriske neurons finnes i muskler, hud, visceral organer og bein, blant andre vev. De overføre perifere sensasjon signaler til nerve avslutninger i spinal dorsal Hornet og signaler overføres deretter til hjernen via ulike stigende veier somatiske sensasjon1,2. Somatiske følelsen gjør kroppen til å føle (dvs., touch, smerte og termisk opplevelser) og oppfatte bevegelse og romlig orientering (proprioceptive opplevelser)1,3. Det er fire underklasser av primære afferente axons, inkludert gruppe I (Aα) fibre som svarer til Propriosepsjon av muskler, gruppe II (Aβ) fibre som svarer til mechanoreceptors av huden, og gruppere III (Aδ) og gruppe V (C) fibre som svarer til smerte og temperatur. Bare C fibrene er unmyelinated, mens resten er myelinated til ulike grader.
Nociceptors er primære sensoriske neurons, som er aktivert av skadelige stimuli (mekanisk, termisk og kjemisk stimulering) som bærer potensialet for skade på vev. Disse neurons består av myelinated Aδ fiber og unmyelinated C fiber1,4. Aδ fiber express receptors for nerve vekst faktor (NGF, trkA reseptor), CGRP og SP. C fiber er klassifisert som enten peptidergic og ikke-peptidergic C fibre. På den annen side, uttrykke ikke-peptidergic C fibrene reseptorer for glial-avledet nevrotropisk faktor (GDNF, RET og GFR reseptorer), isolectin IB4 og ATP-gated ion kanal undertypen (P2X3)5,6,7. Nociceptors kan karakteriseres av uttrykk for ionekanaler og aktiveres av nevrotropisk faktorer, cytokiner, neuropeptides, ATP eller andre kjemiske forbindelser8. Ved stimulering, kan nevrotransmittere, inkludert CGRP, SP og glutamat bli løslatt fra sensoriske Nevron terminaler i spinal dorsal horn å overføre nociceptive signaler2. DRG er ikke bare består av nevroner, men også inneholde satellitt gliacellene. Satellitt celler omgir sensoriske neurons og gir mekanisk og metabolske støtte9,10. Interessant er det en voksende mengde bevis som indikerer at satellitt gliacellene i DRG kan være involvert i å regulere smerte sensasjon11.
Sensoriske neurons er rapportert å være mest ofte brukte primære neuronal celler12 og har vært benyttet for elektrofysiologi, signaltransduksjon og nevrotransmitter utgivelsen studier. De er også vanlig å utforske cellulære mekanismer for neuronal utvikling, inflammatorisk smerte, nevropatisk smerte, hud sensasjon (som klør) og axon utvekst12,13,14,15. DRG primære kulturer kan kultivert som dissosiert neurons å vurdere biokjemiske endringer i én eller flere celler, slik at forskere å utføre studier som ikke kan utføres i eksperimentell fag. Nylig DRG var vellykket kultivert fra menneskelige orgel givere som kan ha stor nytte translasjonsforskning16. På den annen side, kan sensoriske neurons også bli kultivert som DRG explants. De DRG explants bevare den opprinnelige vev arkitekturen av neurons, inkludert Schwann cellene og satellitt gliacellene, og er spesielt nyttig å studere samspillet mellom cellene neuronal og ikke-neuronal17. DRG primære kulturer kan lett tilberedes innen 2,5 timer. Cellen sammensetning og egenskaper er svært reflekterende av DRG slik bestemt DRG (lumbale eller thorax DRG) kan samles etter eksperimentelle krav. Kulturer av embryonale og neonatal DRG neurons kreve NGF å overleve og indusere axon utvekst, men kulturer av voksen neurons krever ikke tillegg av nevrotropisk faktorer til media12,17. Der er likeledes kommersielt anvendelig DRG-hybridoma linjer som ND7/23 og F11, som ikke krever bruk av forsøksdyr. Men mangel på forbigående reseptor potensielle kasjon kanal gruppe V medlem 1 (TRPV1) uttrykk (en viktig markør for små sensoriske nociceptive neurons) og incongruent genet uttrykket profiler begrense deres programmer18. Nylig udødeliggjort DRG neuronal cellen linjer ha blitt avledet fra rotten (50B11)19 og mus (MED17.11)20, som er egnet for bruk i høy gjennomstrømming skjermer for narkotika målretting studier. Gene expression profilering for disse linjer har imidlertid likevel skal utføres. Dermed er validering eksperimenter sammenligne disse udødeliggjort cellene sensoriske neurons fortsatt pågående.
NPFFR2 er syntetisert i DRG og translocated til sensoriske nerve terminalene i spinal dorsal horn21. I denne artikkelen gir vi en protokoll for dyrking lumbale DRG celler og behandle dem med en Agonistiske av NPFFR2 å indusere utgivelsen av nevrotransmittere, CGRP og SP. Avhengigheten av NPFFR2 er videre testet med NPFFR2 lite forstyrrende RNA (siRNA), som kan være transfected i kulturperler DRG cellene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne artikkel, vi viser innsamling, enzym-dissosiasjon og kultur av rotte lumbale DRG. Med nevrotropisk støtte fra NGF utvidet axons DRG neurons innen 3 dager etter celle seeding. Utvidet axons var tydelig observerbare etter celler var farget for CGRP protein, som er syntetisert i cellen soma og fraktet langs axon fibrene. Prosessene av satellitt cellene også utvidet, slik at disse dele gliacellene å omgi neurons innen dager. Primære DRG cellene vokst med denne protokollen er egnet for etterforskning cellulære meka…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. M. Calkins for engelsk redigering. Dette arbeidet ble støttet av Chang Gung Memorial Hospital (CMRPD1F0482), Chang Gung University, sunn aldring Research Center (EMRPD1G0171) og departementet for vitenskap og teknologi (105-2320-B-182-012-MY2).
Materials
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
Referências
- Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. . Neuroscience: exploring the brain. , (2007).
- Hunt, S. P., Mantyh, P. W. The molecular dynamics of pain control. Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. . Principles of neural science. , (2000).
- Julius, D., Basbaum, A. I. Molecular mechanisms of nociception. Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).
- Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain. Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).
- Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms. Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
- Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. Role of the immune system in chronic pain. Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).
- Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat. Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).
- Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study. J Neuroinflammation. 8, 126 (2011).
- Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain. Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).
- Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. The peripheral and central mechanisms underlying itch. BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).
- Valtcheva, M. V., et al. Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures. Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).
- Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).
- Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison. Mol Pain. 12, (2016).
- Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line. J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).
- Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors. PLoS One. 10 (6), e0128670 (2015).
- Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn. Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).
- Lin, Y. T., et al. Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice. Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).
- Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia. Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).
- Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain. Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).
