Спинной корень ганглиев изоляции и основной культуры для изучения нейромедиатора релиз
Summary
Спинной корень ганглиев (DRG) первичных культур часто используются для изучения физиологических функций или события, связанные с патологией в сенсорных нейронов. Здесь мы продемонстрировать использование поясничной DRG культур для обнаружения освобождения нейромедиаторов, после нейропептида FF рецептор типа 2 стимуляции с селективным агонистом.
Abstract
Спинной корень ганглиев (DRG) содержат ячейки органов сенсорных нейронов. Этот тип нейрон псевдо-однополярного, с двумя аксонов, которые иннервируют периферических тканях, такие, как кожи, мышц и внутренних органов, а также спинного мозга Спинной рога центральной нервной системы. Сенсорные нейроны передают соматические ощущения, включая сенсорный, боль, тепловой и проприоцептивная ощущений. Таким образом DRG первичных культур широко используются для изучения клеточных механизмов Ноцицепция, физиологических функций сенсорных нейронов и нейронных развития. Культивированный нейроны могут быть применены в исследованиях с участием электрофизиологии, сигнальной трансдукции, нейромедиатора релиз или кальция изображений. С DRG основных культур ученые могут культура диссоциированных нейронов DRG контролировать биохимические изменения в одной или нескольких ячеек, преодолевая многие из ограничений, связанных с экспериментов в естественных условиях . По сравнению с коммерчески доступных DRG-гибридомной клеточных линий или увековечен DRG нейрональных клеточных линий, состав и свойства клеток первичного гораздо больше похожи на сенсорных нейронов в ткани. Однако из-за ограниченное количество культивируемых DRG первичных элементов, которые могут быть изолированы от одного животного, трудно выполнить высок объём экраны для ориентации исследования наркотиков. В текущей статье описаны процедуры сбора DRG и культуры. Кроме того мы демонстрируем лечение клетки культивировали DRG с агонистом рецепторов типа нейропептида FF 2 (NPFFR2), с тем чтобы побудить освобождения нейромедиаторов пептида (пептид связанных с геном кальцитонина (CRGP) и вещество P (SP)).
Introduction
Клетки тела сенсорных нейронов, содержатся внутри DRG. Эти нейроны псевдо-однополярного и иннервируют периферических тканей и центральной нервной системы. Периферических нервных окончаний Сенсорные нейроны находятся в мышц, кожи, внутренних органов и костей, среди других тканей. Они передают сигналы периферийного ощущения нерв, который затем окончаний в спинного мозга Спинной рога и сигналы передаются в мозг через различные восходящем пути соматические ощущения1,2. Соматические ощущения позволяет организму чувствовать себя (то есть, сенсорный, боль и тепловых ощущений) и воспринимать движение и пространственной ориентации (проприоцептивной ощущений)1,3. Есть четыре подклассы первичных афферентных аксонов, в том числе, группа I (aα диалога доступных) волокон, которые реагируют на Проприоцепцию скелетных мышц, группа II (значения) волокон, которые реагировать механорецепторов кожи, и группы III (Aδ) и V (C) волокон в группы, которые реагируют на боль и Температура. Только С-волокна являются unmyelinated, в то время как остальные Миелинизированные в разной степени.
Ноцицепторами являются первичных сенсорных нейронов, которые активируются вредных раздражителей (механические, тепловые и химические стимуляции), которые несут потенциал для повреждения тканей. Эти нейроны состоят из Миелинизированные Aδ волокна и волокна1,unmyelinated C4. Aδ волокна Экспресс рецепторов фактора роста нервов (ФРН, Ведьмина рецепторов), CGRP и SP. С-волокна, классифицируются как peptidergic и не peptidergic С-волокна. С другой стороны не peptidergic С-волокна Экспресс рецепторов для глиальной нейротрофического фактора (рецепторов GDNF, RET и Федеративная Республика Германия), isolectin IB4 и АТФ закрытый ионного канала подтип (P2X3)5,6,7. Ноцицепторами можно отличить выражением ионных каналов и активированную нейротрофических факторов, цитокины, Нейропептиды, АТФ или других химических соединений8. После стимуляции нейротрансмиттеров, включая CGRP, SP и глутамат может быть освобожден от сенсорных нейронах терминалов в спинного мозга Спинной рога для передачи сигналов ноцицептивных2. DRG состоят не только из нейронов, но также содержат Спутниковое глиальных клеток. Спутниковое клетки окружают сенсорных нейронов и обеспечивают механические и метаболизм поддержки9,10. Интересно, что существует растущий объем свидетельств, указывающих, что Спутниковое глиальные клетки в DRG могут быть вовлечены в регулировании боли ощущение11.
Чтобы быть наиболее часто используемые первичной нейрональные клетки12 и были использованы для электрофизиологии, сигнала и нейромедиатора релиз исследований сообщалось сенсорных нейронов. Они также часто используются для изучения клеточных механизмов развития нервной системы, воспалительные боли, невропатической боли, ощущение кожи (как зуд) и аксон нарост12,13,14,15. DRG первичных культур может культивировали как диссоциированных нейронов оценивать биохимические изменения в одной или нескольких ячеек, позволяет ученым для проведения исследований, которые не может быть выполнена экспериментальная предметам. Недавно DRG были успешно культивировали человеческий орган доноров, которые могли бы пользу трансляционного исследования16. С другой стороны Сенсорные нейроны могут также выращиваются как DRG эксплантах. DRG эксплантов сохранить оригинальную архитектуру ткани нейронов, включая Шванновские клетки и спутниковое глиальных клеток и особенно полезны для изучения взаимодействия нейронов и не нейрональные клетки17. DRG первичных культур можно легко приготовить в течение 2,5 ч. Клеточный состав и свойства высокой отражающей способностью источника DRG, и таким образом, конкретные DRG (поясничный или грудной DRG) может быть собрана по данным экспериментальных требования. Культурах эмбриональных и неонатальной DRG нейронов требуют NGF выжить и вызвать нарост аксона, но культуры взрослых нейроны не требуют добавления нейротрофических факторов к СМИ12,17. Существует также коммерчески доступных DRG-гибридомной клеточных линий, таких как ND7/23 и F11, которые не требуют использования экспериментальных животных. Однако, отсутствие Переходный рецепторный потенциал катионного канала член subfamily V 1 (TRPV1) выражение (важный маркер для малых сенсорных нейронов ноцицептивных) и несовместимые ген выражение профили ограничивают их приложения18. Недавно увековечен DRG нейрональных клеток линии были получены от крыс (50B11)19 и20мыши (MED17.11), которые подходят для использование в экраны высокой пропускной способностью для ориентации исследования наркотиков. Однако выражение гена профилируя для этих клеточных линий еще предстоит выполнить. Таким образом еще продолжаются эксперименты проверки, сравнивая эти увековечен клетки для сенсорных нейронов.
NPFFR2 синтезируется в DRG и арестовано сенсорные нервные окончания в Рог спинного мозга Спинной21. В этой статье мы предоставляем протокол для культивирования поясничного DRG клетки и относиться к ним с агониста NPFFR2 побудить освобождения нейромедиаторов, CGRP и SP. Зависимость от NPFFR2 Далее проверяется с использованием NPFFR2 малые интерферирующие РНК (siRNA), который может transfected в клетки культивировали DRG.
Protocol
Representative Results
Discussion
В настоящей статье, мы демонстрируем коллекции, фермент диссоциации и культуры крыса поясничный DRG. При поддержке нейротрофических ФРН аксоны нейронов DRG расширена в течение 3 дней после посева клеток. Расширенный аксоны были явно наблюдаемой после того, как клетки окрашивали CGRP белок, ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим д-р м. Калкинс для английского редактирования. Эта работа была поддержана Чжан Гун Мемориальный госпиталь (CMRPD1F0482), Чжан Гун университета, здоровые старения научно-исследовательский центр (EMRPD1G0171) и Министерство науки и технологии (105-2320-B-182-012-MY2).
Materials
| Mixture of tiletamine and zolazepam (Zoletil) | Virbac | Zoletil 50 | anaesthetic |
| Fetal bovine serum | Biological Industries | 04-001-1 | Culture Medium |
| sodium pyruvate | Sigma | S8636 | Culture Medium |
| penicillin/streptomycin | Biological Industries | 03-033-1 | Culture Medium |
| DMEM-F12 | Invitrogen | 12400024 | Culture Medium |
| Poly-l-lysine | Sigma | P9011 | Coating dish |
| Collagenase IA | Sigma | 9001-12-1 | Enzyme digestion |
| Hank's balanced salt solution | Invitrogen | 14170-112 | Culture Medium |
| Trypsin EDTA | Biological Industries | 03-051-5 | Enzyme digestion |
| Pasteur pipette | Hilgenberg | 3150102 | Cell trituration |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma | C6645 | Culture Medium |
| NGF | Millipore | NC011 | Culture Medium |
| NPFFR2 siRNA | Dharmacon | L-099691-02-0005 | Transfection |
| Non-targeting siRNA | Dharmacon | L-001810-10-05 | Transfection |
| NeuroPORTER Reagent | Genlantis | T400150 | Transfection reagent |
| dNPA | Genemed Synthesis | N/A | NPFFR2 agonist |
| CGRP ELISA | Cayman | 589001 | EIA |
| SP ELISA | Cayman | 583751 | EIA |
| CGRP antibody | Calbiochem | PC205L | IHC |
| DAPI | Roche | 10236276001 | IHC |
Referências
- Bear, M. F., Connors, B. W., Paradiso, M. A. . Neuroscience: exploring the brain. , (2007).
- Hunt, S. P., Mantyh, P. W. The molecular dynamics of pain control. Nat Rev Neurosci. 2 (2), 83-91 (2001).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. . Principles of neural science. , (2000).
- Julius, D., Basbaum, A. I. Molecular mechanisms of nociception. Nature. 413 (6852), 203-210 (2001).
- Sah, D. W., Ossipo, M. H., Porreca, F. Neurotrophic factors as novel therapeutics for neuropathic pain. Nat Rev Drug Discov. 2 (6), 460-472 (2003).
- Coutaux, A., Adam, F., Willer, J. C., Le Bars, D. Hyperalgesia and allodynia: peripheral mechanisms. Joint Bone Spine. 72 (5), 359-371 (2005).
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139 (2), 267-284 (2009).
- Marchand, F., Perretti, M., McMahon, S. B. Role of the immune system in chronic pain. Nat Rev Neurosci. 6 (7), 521-532 (2005).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Res Brain Res Rev. 48 (3), 457-476 (2005).
- Nascimento, R. S., Santiago, M. F., Marques, S. A., Allodi, S., Martinez, A. M. Diversity among satellite glial cells in dorsal root ganglia of the rat. Braz J Med Biol Res. 41 (11), 1011-1017 (2008).
- Costa, F. A., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Rev Bras Anestesiol. 65 (1), 73-81 (2015).
- Malin, S. A., Davis, B. M., Molliver, D. C. Production of dissociated sensory neuron cultures and considerations for their use in studying neuronal function and plasticity. Nat Protoc. 2 (1), 152-160 (2007).
- Lin, Y. T., Ro, L. S., Wang, H. L., Chen, J. C. Up-regulation of dorsal root ganglia BDNF and trkB receptor in inflammatory pain: an in vivo and in vitro study. J Neuroinflammation. 8, 126 (2011).
- Liem, L., van Dongen, E., Huygen, F. J., Staats, P., Kramer, J. The Dorsal Root Ganglion as a Therapeutic Target for Chronic Pain. Reg Anesth Pain Med. 41 (4), 511-519 (2016).
- Lee, J. S., Han, J. S., Lee, K., Bang, J., Lee, H. The peripheral and central mechanisms underlying itch. BMB Rep. 49 (9), 474-487 (2016).
- Valtcheva, M. V., et al. Surgical extraction of human dorsal root ganglia from organ donors and preparation of primary sensory neuron cultures. Nat Protoc. 11 (10), 1877-1888 (2016).
- Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).
- Yin, K., Baillie, G. J., Vetter, I. Neuronal cell lines as model dorsal root ganglion neurons: A transcriptomic comparison. Mol Pain. 12, (2016).
- Chen, W., Mi, R., Haughey, N., Oz, M., Hoke, A. Immortalization and characterization of a nociceptive dorsal root ganglion sensory neuronal line. J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 121-130 (2007).
- Doran, C., Chetrit, J., Holley, M. C., Grundy, D., Nassar, M. A. Mouse DRG Cell Line with Properties of Nociceptors. PLoS One. 10 (6), e0128670 (2015).
- Gouarderes, C., Roumy, M., Advokat, C., Jhamandas, K., Zajac, J. M. Dual localization of neuropeptide FF receptors in the rat dorsal horn. Synapse. 35 (1), 45-52 (2000).
- Lin, Y. T., et al. Activation of NPFFR2 leads to hyperalgesia through the spinal inflammatory mediator CGRP in mice. Exp Neurol. 291, 62-73 (2017).
- Yang, H. Y., Tao, T., Iadarola, M. J. Modulatory role of neuropeptide FF system in nociception and opiate analgesia. Neuropeptides. 42 (1), 1-18 (2008).
- Takeda, M., Takahashi, M., Matsumoto, S. Contribution of the activation of satellite glia in sensory ganglia to pathological pain. Neurosci Biobehav Rev. 33 (6), 784-792 (2009).
