Tief dermalen Injektion als ein Modell von Candida Albicans Infektion der Haut für histologische Analysen

Summary

Hier beschreiben wir ein Protokoll, histologische und molekulare Analyse von Hautproben nach Candida Albicans intradermale Injektion ermöglicht. Dieses Protokoll hält die strukturelle Integrität der Haut und erlaubt die Lokalisierung von Gewebe-Resident oder neu rekrutierten Immunzellen sowie die Verteilung der Erreger.

Abstract

Die Haut ist ein extrem erweiterten Organ des Körpers, und durch diese große Oberfläche ist es kontinuierlich Mikroorganismen ausgesetzt. Hautschäden kann leicht zu Infektionen in der Dermis führen, was wiederum bei der Verbreitung von Krankheitserregern in die Blutbahn führen kann. Verstehen, wie das Immunsystem bekämpft Infektionen im sehr frühen Stadium und wie der Host die Erreger beseitigen kann, ist ein wichtiger Schritt um die Basis für zukünftige therapeutische Interventionen gesetzt. Hier beschreiben wir ein Modell der Candida Albicans -Infektion, die die Prozesse zu, die früh während einer Infektion visualisieren, auch wenn der Erreger ist die epitheliale Barriere sowie die Immunantwort ausgelöst durch die C. Albicans vergangen auftreten Invasion. Diese Infektionsmodell verwendet, histologische Analysen durchzuführen, die die Immunzellen zu zeigen, die die Haut sowie die Präsenz und die Lokalisation des Erregers zu infiltrieren. Proben gesammelt, nachdem die Infektion für die RNA-Extraktion verarbeitet werden kann.

Introduction

Der menschliche Körper ist mit einer extrem hohen Anzahl von Mikroorganismen bedeckt. Die Hautoberfläche ist der Lebensraum von fast 1 Million Bakterien pro Quadratzentimeter¹. Diese Zahl spiegelt jedoch nicht die ganze Vielfalt der Mikroorganismen, die die Haut kolonisiert. Neben Bakterien ist der menschliche Körper kolonisiert durch viele Pilzarten, darunter C. Albicans, die in der Lage, sowohl auf die Schleimhaut und die Haut Ebene²überleben.

Der Anteil der Menschen mit der Diagnose mit Pilzinfektionen sind in den letzten Jahren enorm gestiegen. Dies ist vor allem aufgrund der höheren Anzahl von immungeschwächten Personen, d. h., HIV-positiven Patienten und Patienten, die entweder durch Chemotherapie oder Immunsuppressiva nach Transplantation³gegangen. In einer Überwachung Studie in den Vereinigten Staaten zeigten Wisplinghoff Et Al. , dass 9,5 % der Blutbahn Nosokomialinfektionen durch Candida Spezies⁴verursacht wurden. Durch das vermehrte Auftreten von Pilzinfektionen und vor allem wegen der erhöhten Anteil der Candida -Spezies bei Infektionen der Blutbahn gefunden wird verstehen, wie diese Erreger die Steuerung des Immunsystems entkommt extrem wichtig.

C. Albicans ist ein dimorphen Pilz, der in verschiedenen morphologischen Formen wie Hefe, Blastospores, Pseudohyphae und Hyphen abhängig von den Umgebungsbedingungen⁵wächst. In seiner bodenaggregaten Form C. Albicans zeigt seine höchste Kapazität der Invasivität und hat die Fähigkeit, das Epithel⁶durchdringen.

C. Albicans Infektionen sind mit mehreren experimentellen Ansätzen untersucht worden. Das häufigste Modell der Infektion ist die intravenöse Injektion von C. Albicans Hefe⁷. Jedoch wird dieses Modell nicht alle Prozesse, die passieren berücksichtigt bevor der Pilz schafft es in die Blutbahn zu verbreiten. Ein weiteres Modell nutzt die Fähigkeit von C. Albicans , das Epithel einzudringen. Diese Methode, auch bekannt als das Schleifpapier Model⁸, wurde von Gaspari Et Al. 1998⁹entwickelt und besteht aus die Haut, wodurch das Stratum Corneum vor dem Auftragen von C. AlbicansSchleifen mit Schleifpapier. Dieses Verfahren ermöglicht den Pilz, das Epithel, so dass die Analyse der invasiven Fähigkeiten des Erregers zu durchdringen. Zu guter Letzt wurden andere Modelle von Infektionen für die Magen-Darm-¹⁰ und Atemwege¹¹ in verschiedenen Studien verwendet.

Die Bildung einer Wunde (wie im Sand Papiermodell) bewirkt die Aktivierung von mehreren wegen, einschließlich Immunzelle Rekrutierung und Aktivierung, um den heilenden Prozess-¹²zu fördern. Dies kann entweder ändern oder maskieren der Immunantwort, die speziell gegen den Erreger, wodurch verwirrende Ergebnisse ausgelöst.

Hier beschreiben wir eine Methode der Infektion der Haut, die ursprüngliche Wunde Bildung vermeidet und die Induktion einer basalen entzündlichen Umgebung. Um die intakte epitheliale Struktur beizubehalten, injizieren wir direkt C. Albicans in seiner bodenaggregaten Form in die Tiefe Derma. Obwohl eine einzelne Injektion leichte Entzündung hervorrufen kann, ist die Menge der Entzündung begrenzt und eingeschränkt im Vergleich zur Bildung einer offenen Wunde wie Schleifpapier-Modell. Der Ansatz, den wir hier beschreiben ermöglicht die Untersuchung der Immunantwort auf Pilzinfektion und Ausbreitung die übermäßige und bereits vorhandene entzündliche Umwelt durch mechanische Beschädigungen zu vermeiden.

Protocol

Die Verfahren wurden alle unter den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt und unter der Aufsicht des Department of Animal Resources bei Kindern betrieben’s Hospital (Bogen) am Krankenhaus Boston der Kinder oder wurden von den italienischen genehmigt Ministerium für Gesundheit und unter institutionellen Animal Care Committee der Universität Mailand-Bicocca durchgeführt. 1. C. Albicans Vorbereitung Kultur C. Albicans, Stamm CAF3-1<sup…

Representative Results

Durch die Injektion des Krankheitserregers direkt in die Tiefe Derma bleibt die strukturelle Morphologie des Gewebes intakt (Abbildung 1A). Die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität der Haut ermöglicht die Erkennung von Immunzellen und ihre Lokalisation am Ort der Infektion. Die höhere Vergrößerung dargestellt in Abbildung 1 b zeigt, dass der Abszess ist v…

Discussion

Hier haben wir eine Methode von C. Albicans -Infektion des entzündlichen Prozesses zu studieren, die auf Pilz Eingang in die Tiefe Derma initiiert wird.

Obwohl Haut Abszessbildung ein relativ seltenes Ereignis bei C. Albicans Infektion^{15 ist}, Injektion des Pilzes direkt in die Tiefe Derma ermöglicht es, nicht nur das Studium der Pilz-driven Abszessbildung, sondern auch die Analyse der spezifischen Immunantwort Zellen, die teilnehmen, um Pilz Ausbreit…

Materials

Reagents
PBS	Euroclone	ECB4053L	warm in 37 °C bath before use
H-OCT compound	histo-line laboratories	R0030
Gill's Hematoxilyn	histo-line laboratories	09-178-2
Eosin Y solution, alcoholic	histo-line laboratories	09-209-05
Ethanol absolute	scharlau	ET00232500
Citro-HISTOCLEAR	histo-line laboratories	R0050
Eukitt, mounting medium	bio-optica
Acetone	sigma-aldrich	179124
PAS staining system	sigma-aldrich	395B-1KT
Bacto Peptone	BD	211677
Bacto Yeast Extract	BD	212750
D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology	Applichem PanReac	50-99-7
Uridine	Merck Millipore	8451
HEPES	Applichem PanReac	A1070,0500
Safe-Lock tubes 2 mL	eppendorf	30121597
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596018	Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed
Rneasy Mini Kit	QIAGEN	74104
liquid nitrogen			Wear eye protection
Instrument
Coulter Counter-Particle Count	Beckman Coulter
Centrifuge 5415 R	eppendorf
MC 3000 Microtome Cryostat	histo-line laboratories
TissueLiser	QIAGEN
Materials
0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle	BD	324826
Surgical forceps
Surgical scissors
Base mould disposable	histo-line laboratories	2781
Positively charged bio microscope slides	bio-optica	09-2000
Cover slips 24 x 50 mm	thermo scientific	11911998